【讨论】寻找HBV最佳的研究指标！！！
回首往昔，HBV研究进行的红红火火，研究的方法也是层出不穷，却没有什么可喜的成就：有进展，少创新，无突破！此贴的意义就是想了解HBV研究的最新进展，回顾以往的经典，请畅所欲言！
主要打算从两个方面展开：1、抗乙肝病毒的研究；2、对免疫的研究。
1、抗乙肝病毒：最佳的模型是黑猩猩，但很受限制，常用的动物模型有鸭和土拔鼠，转基因小鼠，细胞模型HapG2.2.15细胞株，HepaRG细胞株等，都各有优点，检测指标多为HBsAg、HBeAg、HBV DNA、cccDNA、ALT、AST等。
2、免疫研究：Th1/Th2细胞因子，DC，Tr cells，还有穿孔素，颗粒酶B等等。但是我们都知道这些免疫指标没有一个是特异性的，我们如何来取舍这些指标呢？期待您的参与！
转自丁香园 后面的问题比较庞大，先谈谈为什么到现在没有什么突破。
1.慢性肝炎在我国主要是围生期耐受，问题在免疫和病毒，这里的机制研究相当缺乏。
2.免疫清除期发生的机制和转归也是一无所知。
上面的两条都必须依赖免疫学的研究和进展，需要用免疫的思维对HBV感染进行研究，最近炒得比较热烈的治疗性疫苗，还是需要冷静理智看待。
长征缪小辉教授认为HapG2.2.15中是存在cccDNA，个人觉得也应该存在，这个结论还需要考验，需要更可靠的检测方法来验证。如果正确，那么许多治疗性研究就有了可能的模型。 研究发现穿孔素激活释放需要的阈值是最小的，而fasl和r-干扰素作为效应方式要相对更高的阈值。是表明优先采取穿孔素效应方式还是只是在低MHC表达的情况下才会使用这个方式？可能后者更加可能，那么在病毒清除的后期，应该是以这个方式清除。那么，出现ALT升高就是必然的，如果干扰素或者凋亡的效应相对比较弱，那么后面ALT升高的机会就比较大。而这几个效应模式对于不同的多肽表位，情况又有变化，表明肽的亲和力又和效应方式有关。这样的差异是否可以解释我们在临床上的一些现象？假定清除初期大量的MHC表达，大量的CTL，那么这个时候选择非细胞毒性机制清除病毒显然是有利的，因为机体要把炎症活动控制在一定的范围内。而后期，则要放大炎症反应，采用细胞毒性的方式更加有利。这也说明，单纯干扰素或者凋亡的方式并不能够完全清除病毒，因为，只有大量MHC存在时候，这个效应才存在。
慢性和急性的差别是否在上面的两种效应决定上是有差别呢？所以，即使同样多的CD8特异细胞毒性细胞活化，但是，效应不一样，是否真是如此？
这是读文献的一点想法，恐怕不能够作为最佳的研究角度。 flower1123的发贴有很多收获，不过也有些困惑！
[color=red]是表明优先采取穿孔素效应方式还是只是在低MHC表达的情况下才会使用这个方式？可能后者更加可能，那么在病毒清除的后期，应该是以这个方式清除。
假定清除初期大量的MHC表达，大量的CTL，那么这个时候选择非细胞毒性机制清除病毒显然是有利的，[/color]因为机体要把炎症活动控制在一定的范围内。而后期，则要放大炎症反应，采用细胞毒性的方式更加有利。
我们知道在特异性CTL通过穿孔素发挥作用时必须和靶细胞接触，此时必须通过MHC的限制，但是，乙肝病毒感染的肝细胞往往MHC表达减少，如果MHC表达异常，必然会影响穿孔素的产生和分泌，也就会影响穿孔素的效应，如果正如flower1123所说的那样，在病毒清除的后期采用这种方式显然会导致病毒不能清除，感染慢性化。这似乎不利于清除病毒。为什么机体还会采用这样的清除方式？
还有一个问题：flower1123所说[color=red]非细胞毒性机制[/color]指的是什么，是不是穿孔素－颗粒酶途径和非溶细胞机制。实际上CTL细胞毒效应包括Fas/FasL途径和穿孔素－颗粒酶途径，而r-IFN则是非细胞毒性机制，目前的研究越来越多的表明非细胞毒机制在清除HBV方面的重要作用，似乎我们的思维方式要改变，不要总是想起HBV特异性的CTL才是清除HBV的主力军。
目前正在进行一个实验研究：CHB患者PBMCs中表达穿孔素和正常人是否有差异，半年后应该可以得到结果，到时候与大家共享。 关于乙肝的 研究指标真的是很多，很杂，说不出特异性的指标
比如Th1/Th2细胞因子失衡的研究
有研究IL-18、IL-4/TNF-R比例的；
有用IL-12+IFN-R /IL-10 比例代表Th1/Th2细胞因子的平衡状态；
还有IL-8、IL-10TNF_α、IL_6、IL_12、IL_18、sTNFR、IL_6等等等等
查一下中文期刊数据库，基本没有重复的测同样的细胞因子的
这些因子到底代表了什么意思？
那些因子才有特异性？
最近想测测抗病毒前后这些因子水平的变化，不知道这样研究有没有意义，有没有必要？
请各位同道专家给予指导 [color=red]目前正在进行一个实验研究：CHB患者PBMCs中表达穿孔素和正常人是否有差异，半年后应该可以得到结果，到时候与大家共享。[/color]
有点太笼统了，首先慢性肝炎患者外周很少有HBV特异性的Tcell，其次，可能CTL只有在于肝脏细胞接触的时候才能够决定效应方式，而不是所有的T细胞都可能出现某个效应的缺陷，慢性HBV感染并非免疫缺陷病。希望能够做到值得深究的结果。
如果在大量抗原被递呈的情况下，采取细胞毒性方式，对宿主显然不利，结果重症肝炎。所以，在少量病毒存在的情况下，不能够采取细胞毒性效应方式。但是，对于低MHC表达的情况下，或者说低抗原表达状态下，病毒很容易躲避非细胞毒性效应，可能这个时候，少量MHC表达激活的效应是细胞毒性更彻底一些。
[color=red]最近想测测抗病毒前后这些因子水平的变化，不知道这样研究有没有意义，有没有必要？ [/color]
实际上的目的就是看病毒被抑制后，免疫的极性，抗病毒后存在一定程度的免疫激活恐怕是个共识，被越来越多的人认可，意思不是太大，但是，看看具体的类型倒是可以观察观察。问题一：HBVDNA的减少和免疫直接关系不大，关键是病毒翻译水平的变化影响免疫，如果不存在翻译水平的改变，即使HBVDNA没有了，也不该有大的差异。问题二：我们知道慢性肝炎的发作相当程度类似于结缔组织病，可以出现缓解发作再缓解再发作的周期，表明每次都有诱导特异性应答的原因，发生应答后，维持免疫稳态的调节体系亦反应正常。所以，单纯的治疗前后，观察时间点可能很大的影响结果。 对于国内发现外周血PBMC内病毒复制的问题！
外周血PBMC存在HBV这是已经得到证实的问题！gotosleep 战友已经对其实验方法进行了详细的分析！！
HBV再PBMC中进行复制的话！那我们需要试验来证明的！第一、要有HBV表达的产物的释放！即抗原的释放！如果HBV感染者的PBMC在体外培养能释放抗原的话可以作为一个依据。第二如果HBV在PBMC中复制的话。那么体外培养就能够检测的到病毒颗粒！而且是高滴度的！当然这两个试验中要排除PBMC坏死对结果的影响！！
当然国内许多文献报道HBV感染者精子中存在HBV-DNA，不知道各位对此有什么高见！！ 谢谢gotosleep和医琳师妹对这个问题的探讨。
以下是我的几点意见：
1.关于PCR的敏感性问题，gotosleep战友已经解释了，不再赘述。
2.PCR的特异性问题：我们知道，PCR扩增之前都要设计引物，但是设计出的引物真是那么特异吗，你让它结合谁就结合谁，另外，cccDNA和rcDNA通过离心沉淀并不能完全分离，所以扩增出的DNA完全有可能是以rcDNA为模板扩增的，这就势必出现假阳性。
3.HBV感染PBMC并在其中复制，姑且不论受体问题，暂且人为是“摄取”好了，那么PBMC具有HBV复制的环境吗？我们也可以说，上清液里检测到HBsAg和HBeAg，就应该认为HBV在里面复制了。但是，我觉得检测到抗原蛋白只能说是HBV转录和翻译蛋白了，HBV被PBMC摄取而未被分解的这段时间完全可以转录、翻译蛋白。
4.那么大家又要问了，到底什么才是HBV的复制证据。我认为还是应该选用更灵敏、特异的办法检测到cccDNA，或者转染一段时间后，CsCl离心分离病毒颗粒。
5.关于精子中发现HBV事。我的印象里，很久以前就有人提出，但是后来又说是“吸附”呵呵，又是吸附（PCR才不管是不是吸附呢），最近又有人声称精子中确实存在HBV并可以垂直传播给后代，真是觉得不可思议啊，那样的话，中国的乙肝可就不是10％了。谁有这篇文献，一起挑下骨头。 谢谢医琳师妹的两篇文献。
先说说第一篇《检测血清和精液中HBV-DNA的临床意义》：
1.文献中DNA的提取是从精液中提取的，并不能说明所得的DNA就是在精子里面的，或许是吸附的，或许是精液中别的细胞成分含有的，或者是精液液体本身就含有HBV。
2.我们知道性传播是HBV的一个传播途径，但是只要女方有抗体存在，是不会感染HBV的，精液中发现HBV，只是又一次证明性接触会感染HBV，但和垂直传播不是一回事。总体来说，这篇文章毫无价值可言。
第二篇文献《荧光定量PCR检测HBV感染者精液HBVDNA及其临床意义》：
这篇文章只是将普通PCR换成荧光定量PCR，，与文章所说DNA污染无关。换锅不换药，跟上篇文献意义一样。
若想证明精子染色体携带HBV，只能纯化精子细胞核，并采取无性克隆的方式注入另一个细胞中培养，出现HBV了，才能说HBV有通过父亲垂直传播的可能。 我认为不太可能
理由：1.受体
2.复制环境，HBV的一些增强子必须在肝脏细胞内才具备很好的增强效应，在翻译过程中，蛋白进出膜需要一些分子伴侣，而这些只有在肝脏内才有。
3.免疫：如果外周PBMC中有病毒复制的，而这些细胞是高表达MHC分子，那么这些细胞很容易成为靶细胞而被清除，就可能出现急性感染如同流感早期会出现外周单核细胞的减少。实际上这个现象在人体并不存在。
如果HBV有这样的能力抗拒这些细胞内组成表达的这些溶解颗粒的消化，宁可相信HBV遗传物质在这些细胞内得到保存的可能，因为，很多病原就是这样获得潜伏的。可以检验一下
国外早先用印迹法检测到HBV mRNA，认为可能存在复制过程，但是，仍然无法排除PBMC的吞噬作用的影响，因为，凋亡的细胞就是又这些细胞来清理的，补充一下。
页:
[1]
