【求助】关于HBV DNA基因组转染HepG2细胞后的问题
因为这个问题不涉及到细胞培养问题所以，我把这个帖子发到感染板块了。
我最近在做转染，把HBV DNA全基因组转染到HepG2细胞中，转染后测培养细胞上清中的HBsAg和HBeAg表达量，请问：不同的病人或，药物治疗前后的病人细胞上清中HBsAg和HBeAg表达量理论上是不是应该有所不同？我看文献说，检测培养细胞内及细胞外HBV DNA的复制效率，他们都用Southern 印迹及核酸杂交方法，如果我直接收集细胞上清然后作上清中HBV DNA定量检测，这个结果能不能代表HBV DNA的复制能力呢？
对乙肝病毒基因组在体外的复制情况不太了解，请各位感染科战友、专家做个指导，谢谢！
转自丁香园 所谓转染即采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组?噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。
而转染成功后，目的基因的表达水平最主要与相应基因的启动子有关系，也就是说你检测到的蛋白水平实际上是对启动子活性的一种检测，而不是反应该病毒在新模型中的复制水平的检查。
为了保证稳定高效表达，我们在构建质粒通常是选用高效的转录启动子加上目的基因，也就是我们使用的通常不是原来该基因的启动子，所以你要检查一下你的启动子是什么？如果不是病毒原来的启动子，那你在上清中检测的对于生物模型而言是没有什么意义的。 这个实验在人体内做并没有多大的难度,不知道楼主为什么不考虑直接在人体内做,而选择了一个说服力大为降低的模型中去做.由于目前的核苷类似物一类的药物,是通过对DNA多聚酶的影响,其必定会在用药期间发生基因表达水平上的变化，用药之后还应该区分变异和不变异两种情况.我还是不太明白这个题目的意义.
是研究药物对病毒遗传进化的影响?又任何区分免疫对其的影响?
由于HEPG2.2.15细胞中宿主细胞RNA合成酶的情况和活体正常肝脏细胞就存在差异,就此一点就可能影响到病毒基因表达的情况.
在生物信息版读到一篇NATRUE的文章,是说关于科研思维的,其中就提出了一个观点,对我们做学生的很有启发,我们的思维不该局限在如何解决导师交代的具体任务,而应该想想,是否有必要做这个任务,当然,这样的思考现阶段也只能够停留在思考上,你可以把你的疑问向你老板请教,听听他的意见. 楼主说：我的课题是研究药物治疗前后的基因表达差异的。
提取治疗前后患者血清中的HBV DNA，然后转染到HepG2中，看治疗前后有哪些基因表达有差异。
如果像gracehelix 说的，我可以直接在体外用药物对HEPG2.2.15细胞进行干预，然后观察干预前后基因表达的差异。
按gracehelix说的，那后者更方便更快捷；我有时候也搞不清楚，为什么课题设计时不用后一种方式，而是从患者血清中分离HBV DNA，然后来做研究？？
我想你的导师是基于这样的考虑吧？
1.自己转染，可以省下一笔经费，学到一门技术。
2.做成自己的细胞株，也可以商品化啊。可能自己转染的是不是更能反映国内乙肝病毒的情况？其型别不同于国外？1986年，Sureau等首先报道筛选出能表达HBV全部病毒标志的细胞株。至此，HBV体外培养取得突破，抗HBV新药开发有了一个良好的体外研究工具。在众多培养系统中，以HepG2.2.15在新药体外研究中应用最多。该细胞株是用2个头尾相连的HBV DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外无性繁殖，能够长期稳定的向培养上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的复制中间体，是体外筛选抗HBV药物的良好模型。
3.这篇文章可能有助于你：
HepG2.2.15细胞株中乙型肝炎病毒基因异质性的研究
作者： 王卫峰;周晓东;郑培奋
联系地址： 浙江 杭州浙江医院消化内科 310013
摘要： 目的:以乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因异质性来探讨在HepG2.2.15细胞体内是否存在HBV准种。方法:依据Genebank中HBV ayw亚型全基因序列,选择保守区域设计出特异性多聚酶链反应引物,自HepG2.2.15细胞培养上清中扩增HBV前C/C基因序列,克隆人pGEM-T Easy载体,挑选15个克隆测序以比较病毒的变异程度。结果:测序结果发现HepG2.2.15细胞HBV前C/C基因存在异质性,碱基序列之间的同源性大于93%,突变类型全部为碱基替换。结论:结果提示,长期培养HepG2.2.15细胞内有HBV准种共存,这种细胞模型内HBV异质性现象可能影响其在基因治疗等方面的应用。
楼主说：比如如果我转染的HBV 基因组如果只能表达HBsAg，不能表达HBeAg，这种情况下检测转染细胞内的乙肝DNA，是阳性还是阴性？
是否转染了HBV前C/C基因变异的呢？
最近准备的一个科技攻关计划项目与此有关，刚开始接触这个领域，希望能共同学习。
这个实验不能在人体做，我觉得基于以下两点：1.乙型肝炎病毒存在状态时准种状态2.研究的药物未必获准在人体的应用；2.可能是新药开发。
乙型肝炎病毒存在状态时准种（quasispecies）状态，这是一个不能忽略的问题。在研究抗病毒治疗前后的病毒的基因序列改变的研究中尤其要注意病毒基因准种的特点. 例如，一篇论文研究慢性乙型肝炎的抗病毒治疗前后的病毒基因序列的改变，治疗前留取患者的血清，抗病毒治疗后再一次留取血清，由两份血清提取HBV DNA，应用聚合酶联反应（PCR）技术进行扩增，扩增的HBV DNA片段进行克隆化，各挑取1个克隆进行序列分析，结果发现2个序列存在差别，因此就判定抗病毒治疗前后病毒的基因序列发生了改变，而且认为这种改变与抗病毒治疗的效应有关. 如果慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗前后的HBV基因序列始终各自都是均一的病毒基因序列，或许这种研究方法是可行的，但是，事实上HBV基因序列有准种特点，就是说慢性乙型肝炎患者血清中的病毒，其基因序列，不同的病毒株之间十分相似，但又不同，这种相似性达到95%以上，差别占总核苷酸数的5%以下，这种差别较小，还不足以分成不同的血清型，也不足以分成不同的基因型，但这种差别又是客观存在的. 病毒株之间的差别是一个较为普遍的现象，甚至在患者的血清中很难找到2株序列完全一致的病毒. 因此，我们对于HBV在患者血清中的存在状态，应该是把HBV看成是由不同的基因序列的HBV组成的一个病毒群，而且随着病毒自身复制过程的变化，以及机体的免疫力和抗病毒药物应用的情况，各种病毒在病毒中所占的比例在时时刻刻的变动之中。因此，准种概念之所以十分重要，就是改变了以往人们对于HBV存在状态的看法，换了一种角度来看HBV的存在状态，更为客观和准确. 利用准种的观点来看上述研究结果，就不难看出这种科研设计的局限性. 如果慢性乙型肝炎患者血清中HBV的拷贝数在108拷贝/ml，而且各株病毒间的序列都是不同的，那么在治疗前随机扩增、克隆、测序一个克隆，仅仅代表的是该病毒株而已，与其他病毒无关，没有多少普遍的意义. 如果治疗后，也是随机挑取一个病毒基因序列进行定，也是同样的道理. 但是，治疗前后研究同一个病毒的可能性只有1/10*8，换句话说这是不可能的. 因此，在治疗前后，根本就是对于2株肯定不一样的病毒基因序列进行比较，这样的结果与治疗的效应又有何干？因此，不能对于治疗前后各1个或少数的病毒基因序列进行测定来研究抗病毒治疗前后病毒基因序列的改变，这种差别根本就不可能与治疗的效应有关。也就不能在人体进行研究。 刚看到这个帖子，比较有技术含量！
我谈谈自己的看法：
对于楼主的课题我有如下疑问：
1.从患者血清中提取的病毒基因组为环形DNA，如果用单一拷贝进行转染，必然要将环形病毒基因组打开从而变为线性，势必破坏至少一个病毒开放读码框，肯定会影响相应的蛋白产物。正因为此，所以2215细胞采用首尾相连的2拷贝病毒基因组进行转染，才能保证病毒完整的翻译和复制。不知楼主如何解决此问题？
2.病毒基因组转染HepG2细胞后，如何实现自我复制？是否整合到细胞染色体中？随机整合还是定向整合？
目前尚无理想的HBV体外复制模型，关于HBV体外复制仍然存在诸多空白。楼主的课题着眼点很好，似乎难度颇大。
xinjidechun 战友所言甚好，只是忽略了一个问题：准种是病毒存在的方式，但也有相对性。举一个例子说明：
对于一个未进行过抗病毒治疗的HBV慢性感染者而言，他体内的乙肝病毒以准种的形式存在，甚至可以包括YMDD变异株，但是如果进行病毒序列分析，我们很难发现YMDD株，这就是概率问题，毕竟相对于野毒株，耐药变异株还是非常少的。当此患者治疗服用贺普丁出现耐药性后，此时他体内的病毒仍然是以准种的形式存在，但进行病毒序列分析时，却很容易分离出YMDD变异株，这也是概率的问题。
所以我们不能因为病毒的异质性而放弃对于病毒共性的研究，随机克隆恰恰反映的就是病毒的优势株。 莫伊凡战友分析的确实精彩，但就准种问题，我补充一下自己的看法。
1.您说的概率问题，我是承认的，可以比作统计上的P值，但在研究上，这与统计上的P值是不一样的。人们把概率值小于0.05的事件称为小概率事件。小概率事件几乎不可能发生。如果概率值小于0.01，则发生这种事件的可能性更小了。作为一个医学统计是可以这样理解的，但作为科研，得出的结论就值得商榷了。世界上有多少人做科研，如果允许哪怕是0.001的错误，恐怕就是一个相当可观的错误。
2.个人通俗的理解准种：比方说人，可能从一个宏观来看，都是差不多的，基因有高度的相似性，但世界上没有两个完全一样的人，即使同卵双生。有两株完全一样的病毒吗？（即使感染了一株病毒，但在不断的复制中，变异是肯定存在的，不论是否有免疫压力与抗病毒压力）不知道是不是危言耸听了，摘录北京302成军教授的一段文章与大家一起学习一下：
1.概念：不同的HBV感染患者体内的HBV基因序列是不同 的，也得到了人们的广泛的重视，这就是HBV不同的基因型（genotype）和血清型（serotype）。但是，针对HBV感染特定的患者来说，虽然个体病毒基因突变的研究得到 了重视，但体内不同的HBV拷贝之间基因序列的关系究竟如何，多少年来相对受到忽视. 研 究表明，HBV感染个体的体内HBV不同病毒基因序列在统计学上高度一致，基因序列的同源性 高达95%以上，但每株病毒的基因序列都不相同，这种差别较小不能构成不同的基因型和血 清型，但的确又不相同. 准种（quasispecies）概念的提出就是描述HBV感染个体体内不同 病毒株基因序列高度一致，但又有差别的一种存在状态。
2.乙型肝炎病毒准种特点的临床意义：
关于HBV基因的异质性和准种特点的研究，对于HBV生物学特性及临床研究都有十分重要的意义. 因为在此之前对于HBV的研究，大多是以独立的HBV病毒株进行研究的，而很少将HBV当成一个基因序列不均一的病毒群体进行审视. 因此，准种概念的引进，就是引入群体的概念，替代个体的概念，同时，引入优势种群的漂变，替代个体病毒基因序列的改变，使我们对 HBV的认识更加深入、全面而合理. 这种认识方面的改变，对于HBV研究具有深远的影响 。
首先，在HBV基因的异质性和准种的研究中，各种不同类型的基因突变，包括缺失突变、插 入突变、碱基颠换突变、以及准种等多种类型，都能在HBV基因序列分析中看到。HBV DNA复制过程中存在校读偏差，这是HBV DNA序列异质性存在的内因，其次HBV还要 受到机体的免疫系统及抗病毒药物的选择压力等外因的影响. 变异是绝对的，变异的程度和 速度是相对的.
第二，HBV基因异质性与准种特点的研究，有助于对HBV DNA全基因序列的认 识. 早在1979年就克隆了HBV DNA的全基因序列，随后核苷酸数据库GenBank中收录的HBV DNA全基因序列达200余株，从方法上来说，都是分段克隆的，然后根据重叠部分的序列，人工 拼接完成HBV DNA的核苷酸全序列. 如果把HBV DNA序列的准种特点考虑在内，那么如果进行 分段克隆时，很可能得到来源于不同病毒株的基因序列，每段克隆所采用的病毒模板是随机 的，很难控制实验条件保证扩增产物的模板来源于同一株病毒. 换句话说，这样分段克隆的 HBV DNA序列在自然界是不存在的，这只是一种人工拼接的HBV DNA序列。
第三，HBV基因异质性与准种特点的研究，有助于全面理解HBV基因突变的特点和规律. 如果 从准种这一角度来看HBV的基因变异，因为很难控制所得到的HBV基因片段总是来源于同一病毒株，因此，关于HBV基因突变及其生物医学意义的研究方法应该谨慎选择. 如果仅仅是在病情变化前后或治疗前后，对于少数的HBV基因片段进行序列分析，然后据此作出HBV基因突变及其临床意义的结论是不可靠的. 因为在血清中的HBV的基因序列本来就是不一样的，如果不能保证在研究过程中扩增获得的HBV基因序列来源于同一个病毒株，那么这种基因序列的比较是没有任何意义的，更不能做出这种基因突变的任何生物学和临床意义的解释。
第四，HBV基因异质性与准种特点的研究，有助于研究和了解HBV DNA准种形成 的原因以及与临床表现和转归之间的相互关系，这是研究HBV DNA准种特点重要意义所在。关于机体的免疫压力以及抗病毒药物的选择压力在HBV DNA准种形成过程 中的地位和作用，以及HBV DNA准种的形成与急性HBV感染的慢性化、慢性HBV感染的临床转 归之间的相互关系的研究，将为探索抗HBV感染的治疗方法提供重要线索。
第五，HBV基因异质性与准种特点的研究，对于HBV防治研究的未来将产生不可估量的影响. 因为在进行有效检测、有效免疫预防和有效抗病毒治疗之前，HBV感染在人群中的分布是相 对随机和自然的。但是，随着对于HBV检测、预防、治疗措施的发展和应 用，HBV感染的传播方式即已发生了根本的改变.因为这种人为的干预和HBV准种的随之漂变，目前流行的HBV感染病毒株特点与此之前的病毒种群相比较，已经发生了根本的改变，并将继续发生变化。因此可以想象，未来的某一天，到HBV种群的改变达到一定程度，以往的检测手段不再有效，漏检率会大幅度提高，献血员的筛选不再有效，输血不再安全；根据以前HBV流行株构建的基因工程疫苗的免疫预防覆盖率将会逐渐缩小，免疫预防不再有效保护大部分易感人群；目前抗病毒治疗有效的药物筛选的结果，使抗药病毒株 成为优势种群，常规的抗病毒化疗药物不再有效。那时，HBV感染的防治 将会更加困难. 因此，从现在开始就必须给予准种的研究以充分的重视，否则，HBV感染的 防治在不远的将来会进入一个十分尴尬的境地，这决不是危言耸听。 这样的讨论很好，能学到很多东西。
我曾经做过HBV感染HepG2细胞的实验，有点自己的认识。HepG2细胞并不支持HBV自然感染，尽管病毒可以进入细胞浆，但是无法完成自我复制，我实验得出的结论是：在HepG2细胞内HBV无法完成脱衣壳过程。
楼主的试验恰恰绕过了HBV脱衣壳过程，直接导入裸DNA，可以实现病毒短期复制。
关于HBV在细胞内的复制过程，首先应该复习HBV体内自然感染过程：
HBV进入肝细胞后，在病毒聚合酶（也许还有细胞蛋白的辅助）作用下，脱掉衣壳，进入胞核中，形成cccDNA，而cccDNA构象为超螺旋，还结合有细胞组蛋白成分，非常类似于细胞染色体结构，所以可以稳定的存在和转录表达。
我个人认为HBV裸DNA导入细胞后，应该是以染色体旁附加体的形式存在，类似于细菌质粒。但是由于缺乏病毒蛋白和相应细胞蛋白的辅助，所以构象上可能不同于cccDNA，导致无法稳定存在，转录表达能力也会显著下降，相对而言，S抗原启动子较强，可能表达水平受影响较小。
楼主实验目的在于考查不同患者HBV复制表达能力，按照这样的技术路线，病毒复制表达的能力将很大程度上取决于瞬时转染的效率，以及病毒DNA在细胞内的稳定程度，特别是转染时有多少裸DNA可以进入细胞核。对于只是进入胞浆而没有进入胞核的DNA，由于缺乏病毒蛋白的辅助，很难实现核转位。
关于准种的意义，目前国内权威们也在喋喋不休的争论，见仁见智很正常。此外，“居群”的概念，及目前很热的HCV区室化问题等等，这样的学术谈论有助于学科的发展，也欢迎大家发表自己的意见。 on_the_way wrote:
关于准种，我还是想重复一下我的问题：意义到底有多大呢，成军教授的这篇文章，我以前也看到过，但他只是提出了准种的存在，说要把体内的乙肝病毒看作一个群体来看；我们之所以要研究病毒，无非想看看这个病毒治疗前后或病情恶化前后其毒力是否有所改变，如果治疗前后准种数量有所改变或准种优势株发生改变，但这些准种之间的毒力、致病性没有明显的差异，那么研究同一患者体内病毒的准种改变又有什么意义呢？？？
不知道我的问题说清楚没有，希望能得到解释。谢谢！
关于准种，我有个设想，提取同一患者同一时期体内的不同HBV DNA，然后做体外研究，比如转染后复制能力的变化、对药物的敏感性、对动物的致病力等等，这样研究是否有意义？？
我觉得楼上的提的这个问题非常的好,很多时候,我们研究一个问题,就会在手段中间迷失.准种概念的提出,实际上告诉我们这样一个道理,即使是一个基因序列相同的病毒感染一个人,也会出现病毒遗传多样化,回到病毒学上有个理论,病毒寄生的目的,其中就包括了基因库的扩大.只有基因库的扩大,才可能增加遗传优势,得以继承.所以,病毒基因多样化并不是HBV独有,几乎所有的病毒都应该有.这似乎不好解释有些已经完全消灭的病毒,但是,如果从病毒的进化树的角度来研究,就会发现很多病毒之间其实是有遗传物质的交叉.
那么对准种的研究究竟有多大意义?如果只是停留几乎没有意义.准种"准"在何处,是个比较有意思的疑问,找到病毒最保守的核酸序列,发现这些序列在疾病慢性化和进展中的意义,针对这些表位,设计疫苗,也许是病毒的一个致命的弱点.因为保守区域所以保守,是因为它对病毒的正常的复制和感染能力是至关重要的,稍微的变异,由于其功能的丧失,而很快被选择淘汰.
准种的发生,对于病毒持续感染也是有益的,无论是逃避免疫还是适应不同个体变异的细胞内复制环境.
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