酶联免疫吸附试验及其应用 （转载）
酶联免疫吸附试验及其应用 近二十几年来，免疫学检测方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，检测方法的敏感性和特异性都得到极大的提高。50年代和60年代诞生了免疫荧光（IFA）和放射免疫(RIA)方法，70年代又建立了酶标记技术。由于酶具有生物催化作用，短时间内可以催化大量底物分子发生反应，使原来微量的抗原或抗体在数分钟内以颜色变化的形式表现出来，这种方法就是 酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。ELISA法使免疫学检测方法变得更敏感、特异，方便、快捷。目前，ELISA方法已广泛应用于多种疾病（包括病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面）的免疫诊断。几十年的临床应用，ELISA已被公认具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。适合临床检验科常规检测，也适合大规模普查；可以用来检测抗体（IgM、IgG、IgA等），也可用于测定抗原，是一种辅助诊断的可靠方法。
ELISA方法的基本原理和方法
ELISA 的基本原理就是将抗原抗体固定到特定的载体上进行反应，并通过酶催化底物发生化学变化将抗原抗体反应通过颜色的形式显现出来。主要步骤分为如下5个部分：
（1）将抗原抗体反应固相化：即试验中的包被环节，使抗原或抗体吸附于固相载体表面。其机制可能是聚苯乙烯表面间的疏水基团可以无选择性地吸附蛋白分子。此物理性吸附不破坏蛋白分子结构，保持其生物学特性和免疫学活性； （2）封闭：固相吸附蛋白是非特异性的，在包被目的免疫蛋白后，未吸附蛋白的固相表面仍然有吸附其它蛋白的能力，为了保障抗原抗体反应的特异性，因此，包被剩余的固相表面应该用抗原抗体反应无关蛋白封闭。一般认为牛血清白蛋白是最为理想的封闭剂，也可用脱脂奶粉、明胶、牛血清替代。
（3）抗原抗体反应：抗原或抗体在适当的介质下可进行特异的抗原抗体反应。
（4）酶反应：酶可以通过共价键与抗原或抗体连接形成结合物，当抗原抗体反应的时候，被检测靶目标中也结合了酶分子。
（5）底物反应：结合在抗原抗体中的酶分子，可以促使底物发生颜色反应，检测人员可以通过颜色来判定是否有免疫反应的存在，并可通过颜色的深浅判断标本中相应抗原或抗体的含量（颜色反应与抗原抗体的含量成正比），可以裸眼观察，也可借用酶标仪在适当的波长读取吸光度值。
常用的 ELISA 方法
一 以测定抗原为目标主要有如下几种方法
1.竞争法（ Competition method ） : 首先将特异性抗体包被（ Coated ）于固相载体，一般故乡载体选用聚苯乙烯材料。经洗涤封闭后分为两组：一组加酶标记抗原与被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育、洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。 2.双抗体夹心法 首先用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤、封闭后加入待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，用颜色的深浅进行抗原的定性、定量分析。 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于 5000 的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。 HbSAg 及 HbS 的测定。 3.改良双抗体夹心法：该方法是双抗体夹心法的一种改良形式，也是用于测定抗原的。步骤如下：
3.1：包被、封闭：首先是将特异性抗体a包被于固相载体，洗涤、封闭；
3.2：加样：加入待检样品，孵育洗涤；
3.3：加抗抗体：加未标记的特异性抗体b （与包被抗体来自非用同种动物），孵育洗涤；
3.4：加酶标抗体：加酶标记抗b抗体，孵育、洗涤；
3.5：加底物显色：加底物显色后可用裸眼观察（定性），或通过在一定波长测定吸光度进行测定。
由于改良双抗体夹心法法与双抗体夹心法多加了一层抗体，因此，放大的倍数更高，更灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。 4.抑制性测定法：首先包被抗原，加入用特异抗体与待测标本混合液，同时设有抗体对照。如标本中不含抗原，则参考抗体未被结合，底物显色程度将与对照一致，而待检标本中含有待检抗原，则显色程度浅或不显色。待检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原量成比例，二者之差，即为待检抗原的量。
二 ELISA方法检测特异性抗体：间接法，也是目前最常用的方法，步骤如下：
1：包被：首先用标准抗原包被于固相载体；
2：封闭：将包被抗原的固相板洗涤，然后加封闭液；
3：加待检标本：将标本（一般为血清，少数情况下是其他体液）加入固相孔中孵育；
4：加酶标记抗体：将酶标记抗体加入固相孔中，(如：检测人抗体则加酶标抗人球蛋白 IgG 或IgM或IgA，孵育；
5：显色：孵育洗涤后，加底物显色，底物显色的程度，与抗体含量呈正比。结果可裸眼观察或用分光光度计在特定波长测定吸光度值。
本法用不同种抗原包被固相载体后，只要用一种酶标记抗人球蛋白，即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人 IgM, 则可用于早期诊断。
ELISA 的临床应用
ELISA 应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上 ELISA 可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。 1.用ELISA方法可检查多种抗原和半抗原：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当；在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等；在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），ELISA检测AFP的敏感性高，与放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断；在传染病的诊断方面正在日益扩大，其中最满意的是用于检查乙型肝炎表面抗原。国内外已有ELISA检测的商品供应。尚有用于检查霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检查免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原，检查病人或病兽的粪便中的轮状病毒，自病人标本中检查甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。还可用于植物组织浆液中检查植物病毒。此外尚试用于测钩体抗原及血吸虫病的循环抗原等。在免疫化学方面可用于检测白蛋白，免疫球蛋白的各种组份，也可用于检测补体成份，如：ciq，还能用于检测蛇毒。 2.用ELISA方法可检测抗体：一般采用用ELISA 间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体，可作诊断。对立克次氏体还可用以鉴别密切有关的种属。也有用于检查鹦鹉热衣原体抗体的报导。试用于病毒抗体检查报告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检查方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。如能进一步改进方法用于检查特异性 IgM ，可以作为早期诊断以及了解体内有关抗原的清除情况。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。
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