提高国家药品标准中HPLC测定方法：问题征集与研讨 转自dxy
药典和国家药品标准是一国政府为保证对在本国范围内使用的药品质量所制订的强制性文件，具有法律效力。提高药典和国家药品标准自身质量水平，是每一新药研究和药物分析工作者的责任和义务。国家药监局国二○○四年二月十二日以〔食药监注[2004]35号〕发文：提高国家药品标准行动计划。药品质控方法左右了药品质量，直接关系到我们每个人的利益。我希望丁香园里的朋友们能够在各自的岗位上，为[提高国家药品标准行动计划]做贡献。比如：对在执行中国药典和国家药品标准中采用HPLC作为质控方法的大讨论，对自己在实际工作中面对的问题、现象、意见等，在此提出各自的新思路、新方法，为提高国家药品标准质量做出一点贡献。
相信丁香园的分析技术版应该发挥自己的力量与影响力。
我本人仅先提出二个问题，作为抛砖引玉，仅供大家讨论和斧正。意见、方案和答案，总结时再亮相。
对于首先提出问题发贴并引起大家响应者跟帖者，我建议版主对每一问题的首发帖者加分鼓励。
1. 马来酸氯丙那敏(也称扑尔敏),国标中有10多个品种的HPLC方法测的不是或测不出氯丙那敏的主峰。
2. 沙星类药物的HPLC测定方法易造成主峰明显托尾现象，在数不少，有改正余地。
对符合如下发贴格式的，将根据创新性、先进性和实用性等指标，按帖子的质量水平，给予1-3分的奖励。
【药名】
【标准号】
【标准附件】
【问题】
【经验讨论】 我首先提出一个问题，在我国众多复方感冒药中，近半品种含有扑尔敏，也称为马来酸氯丙那敏。我国在94年之前发表的研究论文中，用HPLC测定扑尔敏含量分析方法的文章几乎都是错的。即便又过了十年，国内发表的研究论文和制订的药品标准重复这种错误的仍不少见。为什么这样说呢？
我们大家都知道，在九十年代的一场抗洪救灾中，救灾药品氟哌酸被查出技术性假冒，国家药政部门只好改分光法为HPLC法，以防作假。但现有的许多测定扑尔敏含量分析方法都不适宜。实际上测定的只是酸根马来酸，而真正的主药氯丙那敏并没有测定到(一般流动相中，只可看见马来酸，主药氯丙那敏保留时间过长或严重拖尾，被误认为是辅料或杂质。这既不科学，又给不法分子可乘之机。我在94年曾先后在一些会议和讲座中，向部分同行汇报过，也获过优秀论文和奖励。但未能作过更广的宣传。还有不少品种干脆不测扑尔敏(马来酸氯丙那敏)。我测定过多种此类药品，发现扑尔敏含量波动较大。且如果按照某些文献或药品标准的方法，差异更大 【药名】氧氟沙星注射液
【标准号】中国药典2000年版
【标准附件】中国药典2000年版
【问题】发现在氧氟沙星的主峰前有一个小杂质峰与主峰无法有效分离。
【经验讨论】 中国药典2000年版已收载有氧氟沙星注射液,其含量亦采用ＨＰＬＣ法。我们采用该法进行试验后发现在氧氟沙星的主峰前有一个小杂质峰与主峰无法有效分离。采用文献的色谱条件:0. 05ｍｏｌ·Ｌ-1枸橼酸溶液 0. 05ｍｏｌ·Ｌ-1醋酸铵溶液 -乙腈- 1%磷酸(75∶1∶22∶2)进行试验时发现,氧氟沙星主峰前的杂质峰被包进氧氟沙星主峰内。以上的色谱条件都无法准确的测定出氧氟沙星的含量,经多次试验后发现以0. 05ｍol·Ｌ-1枸橼酸溶液∶乙腈=83∶17(用三乙胺调节ｐＨ值至4. 0)为流动时,主峰的峰形好,与各杂质峰能达到有效分离。 与HPLC专家讨论两个问题：
1、马来酸氯苯那敏
【药名】复方岩白菜素片
【标准号】
【标准附件】
【问题】马来酸氯苯那敏的定量
【经验讨论】主要成份电离给HPLC定量造成困难。
今年年初我们做了一个含有扑你敏的化药复方。在做含测标准时，发现马来酸氯苯那敏在HPLC图谱中分成两个峰，不过前一个峰小，后一个峰大，实验证实前一个峰是马来酸的峰，后一峰是氯苯那敏。我们以氯苯那敏（后一个峰）定量，经试验，用外标法基本可消除此物质在流动相中电离产生的双峰而带来的误差。经方法学考察证明可行，已收入标准中。现在资料在审评中，前几日有发补通知，但对标准方法未提异议。
我们的色谱条件是：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇—磷酸盐缓冲液（pH=3.49）（64：36）为流动相，流速0.8ml/min；检测波长264nm。理论板数按马来酸氯苯那敏峰计算应不低于3000
2、沙星类药物——乳酸环丙沙星
【药名】乳酸环丙沙星注射液
【标准号】中药国典2000年版
【标准附件】中国药典
【问题】含量测定中色谱表现差的问题。
【经验讨论】上半年进行此品种的仿制。发现按药典方法重现时，峰形不好。原标准的色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.025mol/L磷酸溶液-乙腈(87:13)(用三乙胺调节pH值至3.0)为流动相；检测波长为277nm。理论板数按环丙沙星峰计算应不低于2000，环丙沙星峰与内标物质峰的分离度应符合要求，拖尾因子应不大于4.0。从标准可看出此品种的色谱表现差强人意——拖尾因子4.0左右的峰只能用惨不忍睹来形容了。开始我们用国产柱来做，在做的过程中，发现原条件易出现肩峰，换进口柱后问题得到解决。但没过多久色谱表现就明显变差，后加柱温箱，将柱温升致40篊才搞定。
一个项目下来，我们用了两根色谱柱！
对于这类型的品种，我的经验是：
1、选用进口柱
2、宜且短柱
3、用后认真清洗柱子（水-乙腈 87：13先冲20柱体积以上，再10%乙腈溶液冲，最后纯乙腈冲）
希望对做这类项目的战友有所帮助。 与大家讨论：
1.
【药名】维生素d
【标准号】药典2000版附录
【标准附件】药典2000版附录
【问题】 色谱柱和流速的选择
【经验讨论】 维生素d的含量测定，须先进行系统适应性试验，通过光照使维生素d降解出3个相关产物，并要求四者有良好的分离。药典中只提到流动相和色谱柱的填料。开始我按照一般的情况选用15cm的短柱，和1ml/min的流速，四者不能很好分离。后来请教药检所的老师，采用25cm的长柱，2ml/min的流速，vd3在30分钟左右出峰，并且四者的分离度良好。 与大家讨论：
1.
【药名】阿莫西林
【标准号】药典2005版新增内容
【标准附件】
【问题】 凝胶色谱测定聚合物
【经验讨论】 2005版药典中，阿莫西林增加了采用凝胶色谱法测定聚合物的项目，标准如下：
阿莫西林聚合物 照高效液相色谱法（附录 V D）测定。
色谱条件与系统适用性试验 用Superdex peptide 凝胶过滤色谱柱,以0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）为流动相,流速为每分钟0.8ml；测定波长为254nm。阿莫西林主峰与相对保留时间为0.9的杂质峰的分离度应符合规定。
测定法 取本品约 0.1g ，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相适量，超声处理使溶解后，加2%无水碳酸钠溶液1.5ml（即阿莫西林与无水碳酸钠比例为10：3 w/w）助溶（使溶液的pH值在8.0～8.5之间），再用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取阿莫西林对照品，用流动相配制成每1ml中含0.05mg的溶液，作为对照品溶液，取供试品溶液和对照品溶液各50 μ l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液如显杂质峰，相对保留时间小于0.8的杂质总和应不得大于0.5%；相对保留时间0.9的杂质应不得大于1.0%。
大家可以看到，其中样品的配制溶液为pH值在8.0～8.5之间，实践证明，在该pH范围，正是阿莫西林容易产生聚合物的pH，国内外也有相关的报道了，整个试验测定就算在尽快的时间完成也很难达到要求，不知道这个问题其他朋友有没有遇见过？是否需要重新考虑一下该方法？ 【药名】地奥心血康胶囊
【标准号】2000年版一部-441
【标准附件】
【问题】 鉴别反应和含量测定反应都没有专属性
【经验讨论】 药典标准中，鉴别（1）只要是皂甙类、甾体类物质都有泡沫产生；鉴别（2）也是甾体类物质都具有的特性。故两项鉴别反应都不能保证药物就一定是地奥心血康，只能说明检品中含有甾体类成分。其实为什么不象“地奥心血康”一样，队胶囊也用用TLC鉴别呢？我懂不起了。
另外，含量测定方法也与鉴别反应一样，所有甾体类物质都有沉淀产生，不能杜绝不法分子利用这个漏洞作假。 【药名】马来酸氯苯那敏
【标准号】中国药典2000年版二部
【标准附件】有关物质 取本品，加氯仿制成每1ml 中含50mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加氯仿稀释成每1ml中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述两种溶液各10μl ，分别点于同一硅胶ＧＦ254 薄层板上，以醋酸乙酯－甲醇－稀醋酸(5:3:2) 为展开剂，展开后，晾干，在紫外光灯(254nm) 下检视。供试品溶液除显氯苯那敏与马来酸两个斑点外，如显其他杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。
【问题】用中国药典2000版中的TLC条件进行试验，展开系统为乙酸乙酯：甲醇：稀醋酸（5:3:2）,经反复试验调整系统比例及PH值均不能达到理想的分离效果，均表现为马来酸氯苯那敏样品点拖尾严重，且马来酸和氯苯那敏的斑点未能达到完全分离。
【经验讨论】参照BP95版马来酸氯苯那敏原料药项下有关物质检查的TLC条件，经试验，该条件能够有效检查马来酸氯苯那敏的降解产物和中间体等有关物质 。环己烷－氯仿－二乙胺（5:4:1）;薄层板：硅胶GF254薄层板; 检测方法：紫外灯（254nm）下检视;点样量：10祃; 温度：室温;展距：12cm。 【药名】白芍
【标准号】中国药典2000年版一部
【标准附件】中国药典2000年版一部附录VID(高效液相色谱法)
【问题】甲醇无法完全将白芍药材中的芍药苷完全提取出来.
【经验讨论】 中国药典2000年版一部中收载白芍药材的含量测定项采用的是甲醇作为提取溶媒,提取方法为冷浸4小时后再超声提取半小时,可是根据我们厂质检室多次测定结果表明,此方法无法将药材中的芍药苷完全提取出来,如改用水超声提取,测得的芍药苷含量为原方法的一倍,对此结果我们一向很为难,因各品种上报时要计算有效成分的转移率,我们的成品检验芍药苷采用的是水提法,测出的含量要大大高出理论值,不知各位高手是否遇到过类似情况? 近来因为较忙，所以较少来园子里，今天偶然路过，看到专家嫌各位朋友不够积极踊跃，所以就简单将自己前些时间碰到的一个问题与各位共勉吧。
【药名】黄杨宁片
【标准号】中国药典2000年版一部
【问题】环维黄杨星D含量测定结果非常不稳定。
【经验讨论】我所做的是一个非片剂的制剂，但主成分仍为环维黄杨星D，含量测定方法也和药典方法基本一致为酸性染料比色法。经过多次实验，发现含量测定结果波动很大，非常不稳定，也拿黄杨宁片用药典方法做了对照比较，含测结果仍然波动较大，酸性染料比色法较难控制络合的程度，仍采用酸性染料比色法并对药典方法进行改进后，发现结果仍然波动较大。在《中国药品标准》2004年第五期中有篇文章《中国药典 2000 年版一部环维黄杨星 D 质量标准质疑》也曾经对该标准有过质疑。
所以为了得到稳定的含量测定结果，我们放弃了比色法，尝试用RP-HPLC-ELSD或者直接柱前衍生化，结果：如果用ELSD，峰面积变化稍微有些大，但含测结果也在合格范围内，用衍生化法则结果较好，但该衍生化试剂不易购得，所以经综合考虑后暂时决定采用ELSD法作为该药品的含测方法。
建议药典修改此标准，但具体采用何种方法代替有待商榷，也有文献采用LC-MS方法，但LC-MS普及率目前不是太高，所以药典用这种标准估计也不太现实。
另：我尚没有见到2005版药典的公示内容，不知其中环维黄杨星D的含测方法，不知道是否修订了，如果修订了最好。但不知是用何种方法代替的，请各位朋友告知不胜感激。
最后祝大家元旦快乐，工作顺利！ 【药名】盐酸尼卡地平缓释胶囊
【药品标准来源文号】WS1-(X-316)2003Z
【标准方法】用十八烷基键合聚合物为填充剂，流动相为甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾液(68﹕32)，内标为邻苯二甲胺正丁脂。内标溶液的配制：邻苯二甲胺正丁脂100ml,加入到500ml甲醇中。
【问题】用标准所规定的流动相，盐酸尼卡地平色谱峰有明显拖尾现象产生；而且内标物的选择也不合适。因为邻苯二甲胺正丁脂100ml,加入到500ml甲醇中，太太浪费了有机溶剂，不符合绿色化学的要求。
【经验讨论】我们采用C18柱，流动相改为：甲醇-0.025mol/L磷酸三乙胺缓冲盐溶液(65﹕35)，内标物改为NTD。修改后的标准具有如下优点：盐酸尼卡地平峰形对称，内标物来源易得，且内标峰保留时间适中。内标液的配制可节省9/10有机溶剂。 【药名】爱普列特
【标准号】
【标准方法】有关物质 取本品，加流动相溶解并制成每1ml中含0.25mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用流动相稀释成每1ml中含2.5μg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录VD) C18柱，流动相为甲醇-水-冰醋酸-二乙胺(1000：200：5：0.2)；检测波长为266nm。按爱普列特峰计算，就不低于4000。取对照溶液20μl注入液相色谱仪进行预试，调节仪器的灵敏度，使主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的总和，不得大于对照溶液的主成分峰的峰面积(1%)。
【问题】 标准中采用流动相为甲醇-水-冰醋酸-二乙胺(1000：200：5：0.2)；经我测试，认为加入二乙胺对爱普列特峰无什么影响，而有机胺类是对环境是不利的。
【方法改良与讨论】我研究爱普列特的化学结构，认为采用甲醇-水(83：17)作流动相即可完成分析任务。 药名】吡罗昔康
【标准号】中国药典2005年版第247页
【问题】杂质与主斑点不能有效分离
【经验讨论】 中国药典吡罗昔康有关物质采用TLC法进行检测,英国药典采用HPLC进行有关物质检测.对国产吡罗昔康某一批原料药对比检测发现,采用英国药典HPLC方法,检测到有一大的杂质,杂质含量约为2%;而采用中国药典TLC法检测,未检测到该大的杂质(注:中国药典的总有关物质限度为1%).
提示对生产或研制吡罗昔康原料药或制剂的厂家,应注意加强对有关物质方法专属性的关注和重视.
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