转贴 同一样品hplc压力峰高保留时间规律变化 转自dxy
我刚做hplc遇到一个有趣的现象，并找到了原因，贴出来与大家分享一下液相 hp1050 自动进样 在线脱气机 流动相 甲醇：水＝3：1（超声半小时）
大家看现象的时候可以分析原因，考一下自己，看能否分析对，呵呵
现象：
冲流动相1.5个小时后，基线平稳，压力154bar，压力呈缓慢下降趋势，进第一针，出峰时间16min，峰高125，峰面积2099（过程中压力一直缓慢下降，越每10min下降3bar），通常出峰时间为5.9min，郁闷，以为实习生流动相配错，狂骂之，不过她人不在，我也是心里骂，呵呵。同一样品继续进一针看看，发现出峰时间13min，峰高157，峰面积2102，奇怪，我再进，出峰时间9min，峰高180，峰面积2109，奶奶的，怎么回事，我再进，出峰时间9min，峰高180，峰面积2109，晕啊，我就不信这个邪，
再进，出峰时间7min，峰高204，峰面积2115
再进，出峰时间6.1min，峰高223，峰面积2120
再进，出峰时间5.4min，峰高241，峰面积2124
再进，出峰时间4.8min，峰高259，峰面积2131
再进，出峰时间4.3min，峰高277，峰面积2140
再进，出峰时间3.9min，峰高295，峰面积2143
再进，出峰时间3.6min，峰高311，峰面积2149
再进，出峰时间3.4min，峰高330，峰面积2154
再进，出峰时间3.1min，峰高344，峰面积2151
终于找到原因了
原来，实习生两种溶剂倒在一起后（先水后甲醇），没有晃匀，超声也不充分，产生了梯度分层现象（瓶中从上至下甲醇：水的比例逐渐变大），我晃了一下瓶子发现的这个现象。所以冲流动相的时候存在一个很温和的梯度，进液相体系的流动相甲醇：水的比例逐渐变大（靠这不是传说中的梯度吗，晕倒），所以出分时间逐渐变短，峰高逐渐变高，压力逐渐变低，您猜对了吗？呵呵 这种事情真是闻所未闻啊，简直是一步奇幻小说。楼主应该请哪个实习生同学再演示一遍。
个人觉得疑点如下：
1.除非实习生非常小心谨慎地延壁滴加，否则水和甲醇两相几乎不可能存在分层的问题，毕竟二者是任意比例互溶的。
2.既然已经经过了超声，超声过程中产生的大量气泡将非常有助于搅动流动相加速混和，不用说是超声半小时，这样的流动相我一般超声到没有明显的气泡（每1000ml大约5分钟）就足以混和了。
3.即使存在分层，甲醇的密度是0.8，怎么可能“瓶中从下至上甲醇：水的比例逐渐变大”，何况写明了是先水后甲醇。
保留时间不断提前，峰面积一般应该逐渐降低。
个人认为楼主的情况可能是污染或是色谱柱失活，还是先用异丙醇甚至二氯甲烷等好好冲洗一下吧。 谢谢天赏人间的发言支持
瓶中从下至上甲醇：水的比例逐渐变大 已经更正，纯属笔误
1. 任意比例互溶只是一个结果，而达到这个结果需要一个过程，你不相信可以自己试验一下，先倒水，然后倒甲醇（我问过她，的确是慢慢倒的），放置30min不动，然后晃动一下瓶子，会产生典型的混合现象：产生混乱性折光现象，混和均匀后无论怎么换都不会出现混乱折光现象。实践是检验真理的唯一标准。
2.超声半小时是实习生说的，考虑可能时间实际上很短，超声功率调的太小，并没有使混合进行完全，而是处于一个中间状态。
3.“保留时间不断提前，峰面积一般应该逐渐降低”，不知道有什么依据，我的实验结果摆着呢。如果我说的原因是对的，它确实是模拟了一个梯度过程，只要流动相选的没问题，梯度对峰面积是基本没有影响的。
还有我的柱子是新买的，呵呵，所以不可能是失活，而且我今天做流动相混和均匀后又恢复到正常状态了。
楼上的说“这种事情真是闻所未闻啊，简直是一步奇幻小说”正说明这个现象有趣，呵呵，欢迎高手发表意见。 我也碰到过这种情况，不过使用的是四元梯度泵，泵内自动混合，按道理来说是不应该混合不均匀的呀！不知道该如何解释！ 我认为出峰时间的确是在不断缩短的，但是如果平衡超过柱体积的20倍的流动相冲洗的话，时间变化应该不大。而且即使只冲洗10分钟的话，变化也不会提前在5%的，除非是你的泵系统不够稳定。 楼上说:
我认为出峰时间的确是在不断缩短的，但是如果平衡超过柱体积的20倍的流动相冲洗的话，时间变化应该不大。而且即使只冲洗10分钟的话，变化也不会提前在5%的，除非是你的泵系统不够稳定。
我的解释中讲了，流动相本身就存在上下梯度，怎么冲都不会平衡的，我的泵系统是稳定的，因为除了那次，其余全都正常啊 看来我以后不能偷懒了。我就想的任意比互溶就没拿玻棒去搅拌。不过我们这儿流动相是拿G4的玻砂漏斗抽滤而不是超声。会不会也有问题呢？ 首先并不排除楼主说的流动相混合不匀的状况，其实我也遇到过类似的现象，保留时间不断提前，面积却相对稳定，不过我的流动相绝对是混合均匀的，色谱柱也是新购的。当时我也找了原因，整个过程没有出现失误。后来我又询问经销商，他们的解释是冬天那种色谱柱不太稳定（注：用了柱温箱的）。尽管他们的解释没有依据，但我想这很可能是新购色谱柱的对化合物的保留行为不稳定吧。过了几天这根色谱柱就再没出现这种情况。 若是新的柱子，前几天会出现保留时间不断缩短的情况，这是因为在新柱子的使用过程中，一开始其柱效下降很快，用一段时间后，柱效会相对稳定，保留时间变化就很小了。不过不会差那么多，而且变化那么快。 同意二楼的意见！！！！！支持！
1、要达到楼主说的现象，太难了，除非专门、处心积虑的经营，否则，太难了！！！！
2、超声的混合效果是十分良好的！！除非楼主的超声设备功率太小、或者水太多、或者样品瓶子太重，将超声波压牢了！！！
3、保留时间缩短后，峰面积没有变小是不太可能的！！！而且，楼主的保留时间最后为最初的一半不到，面积肯定要下降许多的！！如果真的没有下降，那么有两种情况：中邪了；或者、、、、、、、（假？？）
不信，楼主自己通过简单的试验看看，你先用1ml/min的流速试验，得到一个峰面积，然后，用2ml/min流速试试，保留时间应该基本为减半，面积也差不多是一样的。
怎么会这样？？？ 3楼说我也碰到过这种情况，不过使用的是四元梯度泵，泵内自动混合，按道理来说是不应该混合不均匀的呀！不知道该如何解释！
这种情况下，出现此情况时，有可能是其中某一元泵堵塞造成。
最近经常看有战友说这个问题，说保留时间不稳定。
曾经就碰到过这个问题，查来查去，最后发现其中有一元泵在规定时间、规定流速内流出的液体的量与理论值不等，因此造成此种现象。
且如果你脱气后或做wet prime的时候会恢复，但随着进样亦开始出现保留时间变化。 以前我分析一个药的时候，流动相用的是缓冲液和甲醇，第一次配制的流动相（缓冲液超声脱气40min，因为仪器本身带有混匀系统，并不是和甲醇再混匀的）主药的保留时间是9.5min，第二次配制的缓冲液（处理方法同上）主药的保留时间是11.9min，整整延长了2.5min。并且溶剂峰的峰形状都变化了，我当时分析的原因是这样的：
缓冲液配制的有差别，也许差别不大，调pH时多少有差别，导致保留时间的变化。不知道对不对？
各位有什么好的意见吗？ 现在调PH都是用PH计吧？PH误差在0.05（我们用的PH是这个样的，梅特勒－托利多，不知大家都是用什么的）
如果PH两次的差异太多会造成与第一次相比保留时间有变化，但是是与前面流动相进的样有变化，之后用这次配的流动相的进的样应该是恒定的。 另外：峰高是随保留时间变化，这个是一定的。
保留时间会随压力的增大而变，我所遇到过的都是压力增大，保留时间有所提前，保留时间提前，峰高变大，但是峰面积基本在仪器的偏差内。
引起保留时间变化，或者有规律的变化的原因也有多种，不是一成不变的，所以要根据各自的情况来推测原因，不能一概而论。 我上次也碰到过这种情况，流动相是甲醇和缓冲液，保留时间由12分钟慢慢移到了4分钟。当时好奇怪，后来才发现是流动相没有混均匀，晕～～～ 因为后来我又把剩余的流动相好好混了一下，再超声，结果保留时间就没有变化了
所以一看到版主的贴我就笑了 原来也有发生相同情况的 虽然以前我也是同样混的但就惟独出现过一次奇遇。现在我都要混好久再超声的 呵呵再也没有出现过此情况了
再分享一下流动相没有混匀的情况 Agilent1100，甲醇和盐的比例是60：40，因为偷懒就分的A B泵机混，但发现同一样品，有时竟然出现了第一针峰面积狂大，第二针峰面积又恢复正常。奇怪了就看看在线的柱压变化。一看才发现本来柱压是一条直线的，现在不规律的出现好多峰（也就是柱压有变化） 原来虽然有在线脱气的功能，但盐和甲醇混的气泡还是留在里面了当在出峰时间变化时峰面积就会有很大的波动。呵呵，自己偷懒的结果啊
虽然折腾了一下，但感觉收获蛮多的，拿出来分享一下，大家就不要再犯同样的错误了 如果不是梯度洗脱，还是自己辛苦一下混了吧
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