拉米夫定相关性HBV变异与临床
都说一年之计在于春，让我们在春意盎然的阳春四月里，一起走进拉米夫定相关性HBV变异与临床的专题讨论吧。欢迎大家就以下问题参与本月讨论：1) 拉米夫定治疗乙肝和乙肝相关肝病的经验，体会和有关进展。
2） 拉米夫定相关性HBV变异与拉米夫定耐药
3） 拉米夫定相关性HBV变异与临床结局
4) 拉米夫定相关性HBV变异的检测及其意义
5) 拉米夫定相关性HBV变异的处理及展望。
等等。
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7. 治疗过程中ALT升高的处理：临床实践中观察到，在拉米夫定治疗早期及以后治疗过程中可能出现ALT升高或ALT复常后再次升高（复升）的现象，应具体分析ALT升高的原因，…………若确认有拉米夫定耐药突变，改用或联合使用阿德福韦治疗有效。目前不能得到阿德福韦治疗的病人可参考以下方法处理：无失代偿性肝病基础病人：ALT<5×ULN、HBV DNA低于治疗前水平，可继续使用拉米夫定，并密切观察病情变化，加强保肝治疗；ALT<5×ULN、HBV DNA高于治疗前水平或持续不降，考虑拉米夫定对病毒的抑制作用下降，可停用拉米夫定或改用其他有效治疗。ALT继续升高达≥5×ULN、或伴有胆红素等生化指标异常，经拉米夫定继续治疗一段时间后仍无好转，建议改用或加用其他有效抗病毒治疗和支持治疗；也可在严密监测下停用拉米夫定，并连续至少每月1次随访，及时发现病毒耐药突变株和野生株的交替，一旦野生株占优势，且伴有ALT升高立即实施拉米夫定再治疗。有失代偿性肝病基础病人：一旦发生耐药突变和肝炎发作，应慎重处理，原则上应继续使用拉米夫定。如ALT≥5×ULN、或伴有胆红素等生物化学指标异常，出现肝硬化失代偿迹象者不宜轻易停药，应采取积极保肝支持治疗，并密切观察病情变化。关于失代偿性肝硬化病人接受拉米夫定治疗发生耐药突变后出现病情加重，最近已有使用阿德福韦治疗有效的报道。一项研究中，128例失代偿性肝硬化和196例肝移植后乙型肝炎复发病人发生拉米夫定耐药突变后加用阿德福韦治疗48周后，HBV DNA水平下降3～4 log10，同时伴随ALT水平下降和Child-Pugh积分改善[14]。因此，最近更新的美国肝病学会《慢性乙型肝炎临床实践指南》指出，这类病人改用或加用阿德福韦治疗是最好的选择。
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9. 治疗期间耐药突变的发生、临床表现和处理：有研究报道，未经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎病毒感染者血清中可检测到HBV的YMDD变异株[20, 21]，我国也有类似报道[22]。这种自然存在的YMDD变异株的流行病学、与野生株的比例关系、致病性等均有待于进一步阐明。拉米夫定治疗期间，在药物选择压力下发生的HBV DNA聚合酶YMDD基序变异，则与耐药突变（resistant mutation）相关，其中99%表现为YVDD或YIDD变异（rtM204V/I，曾称M552V/I）。YMDD突变常伴随另一个位点突变（rtL180M，曾称L528M），即在YMDD基序上游第24位的亮氨酸被蛋氨酸取代。一般来说，YMDD突变常发生在拉米夫定治疗6个月以后，并随继续治疗时间延长发生率逐渐增高。初次拉米夫定治疗1年时YMDD突变发生率为14%～32%，2年、3年、4年发生率分别为38%、49%、66%[16, 23]。近已观察到有些拉米夫定再治疗病人发生耐药突变的时间相对提前。已有研究证实，ＹＭＤＤ变异株复制活力较野生株低，停用拉米夫定后野生株很快恢复为优势株。未达血清转换病人发生耐药多在停药3～4个月后突变株逐渐减少，野生株恢复为优势株。治疗期间发生YMDD突变后病人临床表现形式多样。最初表现为突破感染（breakthrough infection），即血清HBV DNA水平下降或阴转后继续治疗时阳转或明显上升。部分病人可无临床症状、ALT正常，类似免疫耐受；也有部分病人出现肝炎发作（hepatitis flare），ALT水平升高，可能由于突变株激发的免疫反应所致。对临床表现轻微的病人继续拉米夫定治疗大多数仍可获益。但也有少数病人，特别是肝脏储备下降的病人如肝硬化及肝功能失代偿者，在继续拉米夫定治疗时病情加重，应引起临床重视。病毒耐药突变与病情加重之间的因果关系尚未阐明，肝脏病变基础和肝功能的代偿能力可能是重要的影响因素，应进一步加强对临床表现及治疗的研究。出现耐药突变后伴有病情加重时，建议在加强综合治疗措施同时，采取积极有效的方法，如改用或联合阿德福韦治疗。体外实验证实，YMDD变异株对拉米夫定的耐药性增强，可能与其对拉米夫定亲和力下降有关，但这种实验室耐药并不一定等同于临床耐药。当检测出YMDD变异后继续拉米夫定治疗，部分病人病情仍可继续改善，可能与拉米夫定对残余野生病毒抑制有关。基础和临床研究已经证实，某些核苷类似物，如阿德福韦、恩替卡韦（entecavir）等对YMDD变异株有抑制作用，临床治疗有效。对于拉米夫定治疗过程中发生耐药突变病人，当前欧洲肝病学会和美国肝病学会推荐的处理方法是：（1）如HBV DNA和ALT水平低于治疗前水平，则继续使用拉米夫定；（2）无肝硬化基础或免疫抑制患者可以中断拉米夫定治疗；（3）改用阿德福韦治疗或联合阿德福韦治疗[5]。YMDD变异的检测方法较多，目前尚无推荐的标准方法，应以国家SFDA批准的为准。值得注意的是，使用拉米夫定治疗后发生的耐药突变常常突变株与野生株共生，尚无推荐的突变株定量检测方法，国外有的研究者以共生病毒中YMDD突变株>5%定义为发生了耐药突变，国内尚未制定相应标准。由于YMDD突变株的载量不同或YMDD突变株在共生病毒中所占比例不同产生的对YMDD突变的界定差异，必然影响到YMDD突变发生后对治疗应答的判断。因此，对耐药突变的诊断，包括有无突变、突变株量的多少、所占比例的大小等，是当前核苷类似物治疗中迫切需要解决的问题。
摘自 2004年拉米夫定治疗共识
拉米夫定作为临床治疗慢性乙肝的一线药物已经近十年，拉米夫定治疗共识虽然经历了多次的修改，虽然它还不是那么完美，在当前的医疗背景下，我始终把它作为临床使用拉米夫定的红宝书。然而，我却从来没有象现在一样仔细的阅读以上的章节。不知道其它的临床大夫是否有同感，拉米夫定进入临床这些年来，随着它的广泛应用，让我越来越觉得它只是一种昙花一现，但我更多的希望只是我的一种错觉。刚开始应用时，最深的印象是对HBV-DNA的抑制作用是如此的强大，几乎所有的患者在2周内发生了阴转，渐渐的这种印象模糊了，觉得更多的是HBV-DNA的持续的阳性，然而现在几乎每天都要面对拉米夫定较长时间服用过程中的肝功能异常患者的询问和咨询，对我的打击最大的是这些患者在此之前所取得的疗效曾让我如此的引以为自豪。我困惑，我迷茫，是因为我和广大乙肝患者一样曾经有过希望，如今希望似乎就要熄灭了。拉米夫定真的就是昙花一现吗？我们到底应该如何评价它？我们到底应该如何更规范的使用它？相关现象的出现对乙肝发病机理的研究有无启发？我们期待的其它的核甘类似物会面临同样的窘境吗？………作为医务人员的我剩下能做的就是寻找答案，以上的描述也许就是最好的答案，对着患者我只能这样反复的向他们解释。但对于我们而言，那只是开始，虽然还有很多很多的东西需要弄清楚，但我们重筑治愈乙肝的希望之路得一直走下去。让我们一起重建希望之路，哪怕我们那么渺小，哪怕我们那么无力，哪怕我们那么幼稚………毕竟我们活着，而且是为了别人而活着。 特别声明：鉴于本人能力有限的原因，时间有限的原因，所得资料的有限，以下所谓论述纯属个人理解，若有错误欢迎指正，但愿在此能启到抛砖引玉的作用.
一）拉米夫定治疗乙肝及相关肝病现状简介
我国是乙型病毒性肝炎高发地区，全国估计有1.3亿慢性HBV感染者，其中有2000万左右是需抗病毒治疗的慢性进展性肝病患者。尽管乙型肝炎病毒所引发的慢性进行性肝脏炎症仍然是目前临床上面临的重要研究课题,其中乙肝慢性化涉及到包括免疫紊乱在内的许多病理生理过程。尽管HBV 的致病机理异常复杂,但目前认为HBV 在体内持续存在是引起多种免疫紊乱的始动因子,只有有效地阻断HBV在体内的复制,直至根除HBV ,才有可能最终阻断和控制肝脏慢性炎性损害,从而消除各种严重并发症。干扰素是目前临床应用的具有确切疗效的抗HBV 制剂,但其总有效率不超过40 % ,并且对“母婴垂直传播”引起的慢性HBV 感染显效率更低甚至无效，相关副作用的出现使得它的依从性大幅的下降。
随着近年来各种抗病毒药物的发展使有效的系统的治疗慢性乙型肝炎成为可能，尤其是核苷和核苷类似物（Nucleoside analogues）的出现使得乙肝的治疗和研究出现了突破。的确十年来核苷类似物的出现，极大的促进了乙肝的理论研究，也极大的丰富了慢性乙肝的治疗，改变了既往慢性乙肝单一干扰素治疗的尴尬局面。拉米夫定，第二代核苷类似物，第一个批准用于口服治疗慢性乙肝的药物，是一种脱氧胞嘧啶核苷类似物,全称2′,3′—双脱氧—3 硫胞嘧啶核苷(β—2′, 3′—dideoxy —3′—thiacytidine) ，通过抑制或干扰HBV病毒复制过程中逆转录酶的活性而发挥其抗HBV 作用，其作用点位于多聚酶逆转录酶活性部位——“酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸” 的YMDD 基序而抑制逆转录酶活性从而抑制HBV DNA 复制，让很多乙肝患者受益。目前拉米夫定应用的范围已经扩展到乙肝相关肝病如肝硬化，乙肝化，放疗，免疫抑制剂应用者预防性用药，肝移植后乙肝再感染的预防，母婴传播的预防等等。
然而随着拉米夫定应用的越来越广泛，自1996年在肝移植患者术后为预防乙肝再感染临床应用拉米夫定治疗的病例中首先发现HBV耐药毒株的存在后，越来越多的拉米夫定应用中HBV耐药毒株的出现也越来越限制着它的临床应用。拉米夫定应用中HBV耐药毒株的出现的原因是什么？？？？目前人们把HBV耐药毒株的出现归咎于拉米夫定治疗中相关变异尤其是HBV-P 基因YMDD 区域的变异的出现。也许拉米夫定应用中HBV耐药毒株的出现的原因并非这么简单，但毕竟已经出现了，而且是在拉米夫定应用中。拉米夫定应用中HBV耐药毒株的出现，让人们在不停地思索着。而且随着各种检测技术的迅速出现，HBV基因中各种不同靶点变异的报道层出不穷，其它靶点的变异的意义是什么？人们在探索着。也许沿着这条路继续走下去，乙肝的彻底有效的治疗就在不远的那一天。但同时我们也应该冷静的思考一下，我们没有在做无用功吧，毕竟病毒的变异是病毒进化的基本特性之一，所谓的各种病毒靶点的变异真的有生物学意义吗？？我们期待着更大的发现。 二)拉米夫定相关性HBV变异
病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一。由于病毒复制校正系统很差，出现碱基序列改变会直接导致蛋白表达改变，病毒的开放读码框架是相互重叠且几乎很少有不表达蛋白的基因序列，这与高等生物含有大量的重复无效基因不同，导致病毒基因的改变会直接影响到病毒性状的改变，使之更容易发生物种进化。这种进化是远远快于人类和高等生物的进化速度,而且在今天这种进化速度似乎远远的超过了人们的想象，SARS的出现使人们惊呼病毒疯了吗？？是谁让病毒迅速进化，这些进化会怎样影响病毒，会怎样影响人类，全人类应该开始反思我们到底应该怎样和这个耐以生存的自然界和谐发展，否则谁也无法预测自然界会怎样惩罚人类。
乙型肝炎病毒和其它病毒一样，它的变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可于发生在应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中通过RNA中间体，在DNA－P和逆转录酶活性是有效而迅速的，但DNA－P缺乏校对酶活性，发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。HBV的前C/C、X、前S/S和DNA－P多个区域均可发生突变、插入或缺失、移框突变等，通常把病毒株分为野毒株（wide strain）和变异株（variation strain），一些变异株对临床预后和病毒学反应具有重要意义，有些变异并无生物学意义。以拉米夫定为代表的核甘类似物的广泛应用，让我们强烈的感受到具有高度保守特性的乙型肝炎病毒的变异也是那么的迅速，随着各种检测技术的出现，出现了越来越多位点的变异的报道。的确这些位点的变异的生物学特性，临床的影响还未完全清楚。但越来越多的研究已经确认拉米夫定相关性HBV变异是尽管是多位点的,但还是相对集中（99％）于P 基因YMDD 区域，所以拉米夫定相关性HBV变异的研究多集中在YMDD 的变异上。
1 HBV DNA 聚合酶结构与YMDD 基序
1． 1 HBV DNA 聚合酶及其逆转录酶RT 区。
P基因是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠。P基因主要编码HBV 聚合酶 。HBV 聚合酶是乙肝病毒复制的物质基础。根据功能的不同, HBV聚合酶从氨基端开始分为四个区 , 分别为末端蛋白区(TP)、间隔区(SD)、逆转录酶区(RT )和RnaseH 区。其中逆转录酶RT 区是HBVDNA 聚合酶的主要功能区, 同时具有反转录酶及DNA 聚合酶活性, 作用是将前基因组RNA反转录成负链HBV DNA , 并以此负链DNA为模板合成正链DNA。HBV 的逆转录酶区可进一步为五个主要的功能域 ,A 区(421～ 436氨基酸)、B 区(506～ 528 氨基酸)、C 区(546～550 氨基酸)、D 区(576～ 589 氨基酸) 及E 区(592～ 600 氨基酸)。这五个区域的氨基酸高度保守, 为维持反转录酶活性所必须, 其中A、C、D 区为酶与三磷酸核苷结合的结合域,B、E 区为RNA 模板和引物定位域。目前临床应用的拟核苷类药物主要的靶位点位于逆转录酶RT区的B 及C 区, HBV 多聚酶的催化域即位于C区的YMDD 基序。
1. 2 HBV YMDD 基序。HBV YMDD 基序即酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸序列, 位于HBV 聚合酶RT 区的C 区, 是HBV逆转录酶的活性部分, 属高度保守序列。YMDD 基序在RT 催化中心的核苷酸结合位点区, 是RT 发挥逆转录酶活性结合底物dNTP、合成DNA 所必须的功能序列, 也是拉米夫定抗病毒时HBV 最常出现变异的区域。
2 HBV YMDD 变异
2. 1 HBV YMDD 变异的含义及其常见的两种发生类型。HBV YMDD 变异是指在位于HBV 聚合酶RT 区C 区的YMDD 基序中, 蛋氨酸M 被异亮氨酸I 或缬氨酸V 所代替, 后者伴有RT 区B 区第528 位的亮氨酸L 被蛋氨酸M 取代的变异(L 528M 变异) , 可伴有逆转录酶其它编码区或HBV 基因组其它位点的变异。HBV YMDD 基序变异通常有Y VDD 变异（1型）和YIDD 变异（2型）两种形式。YVDD 变异是由于HBV P 基因区第739 位的腺嘌呤A 被鸟嘌呤G 取代(A →G) , 则其编码的YMDD 基序中的蛋氨酸M 变为缬氨酸V ,YMDD 变为YVDD，Y IDD 变异是由于HBV P 基因区第741 位的鸟嘌呤G 被胸腺嘧啶T取代(G→T ) , 则其编码的YMDD 基序中的蛋氨酸M 变为异亮氨酸I, YMDD 变为Y IDD。 最近，还发现一种新的变异类型，即YSDD变异或rtM204S变异(以往报告的基本是YVDD或YIDD变异)，这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月的患者的血清中发现的。
2. 2 HBV YMDD 变异的发生背景--长期应用拉米夫定可诱导HBV 发生YMDD 变异。HBV 聚合酶是HBV DNA 复制中的关键酶, YMDD 基序在HBV 多聚酶RT区具有重要作用。HBV 多聚酶的催化结构在自然条件下很少发生变异, 但在长期应用拉米夫定后则极易发生变异, 以多聚酶RT 区C 区的YMDD 基序发生M 552 I 变异(Y IDD 变异)、M 552V 变异(YVDD 变异) 伴B 区L 528M 变异最常见。
3 拉米夫定诱发HBV P 基因区或其它基因区其他部位变异
虽然拉米夫定耐药的基因变异多发生于YMDD编码区,但长期应用拉米夫定还可诱发其他部位的基因变异, 如F512L 、V519L，L526M， A157D和E164D 等变异，还可以诱发乙型肝炎病毒基因组基部核心启动子和前核心区变异，等等，随着时间的延长，还有更多的位点的变异等待进一步的发现，同时这些位点的变异的价值也等待进一步评估。
4 YMDD变异株的生物学特性
HBV YMDD 变异也可自然存在或发生，这种自然存在的YMDD变异株的流行病学、与野生株的比例关系、致病性等均有待于进一步阐明
既往的研究表明，YMDD变异株的复制能力明显的低于野生株。体外试验显示YMDD变异株对拉米夫定的敏感性降低10000倍左右。研究提示，体外的YMDD变异株不能象野生株HBV那样有效的复制，复制能力明显下降。临床也发现，发生YMDD变异后，停止拉米夫定治疗后，野生株可重新替代变异株，提示YMDD变异株存在复制缺陷。
近年来随着对YMDD变异株的研究的进一步深入，发现并不是所有的YMDD变异株都存在复制缺陷，HBVYMDD变异株的复制能力并不是都是减弱的。Ono等的研究结果也提示YMDD基序之外变异可补偿HBV YMDD变异株的复制缺陷，使HBV的复制增强。YVDD 变异同时528 位亮氨酸(L)发生M 变异(1型YMDD变异)时,而此种双重变异则可增强其生长能力，一旦出现耐受性病毒株,部分病例可致发生“突破性肝炎(breakthrough hepatitis) ”,但症状较通常的野生型株所致肝炎为轻，然而也可引起重度急剧恶化。C区和前C区变异直接影响了拉米夫定抵抗变异病毒株的复制能力。前C区变异代偿性的伴有拉米夫定抵抗的复制能力减低，而C区变异则增加病毒的复制水平，即使在拉米夫定抵抗的变异株，其复制能力也超过过了基线的野生株的复制能力。最近发现，YMDD变异伴S 基因“a”决定簇内变异时，病毒的复制能力明显增强，患者可以出现病情恶化。由于HBV P 基因区含盖了整个表面抗原多肽(HBsAg) 编码区,因此,发生于多聚酶编码区的基因变异同样会导致HBsAg 氨基酸的变化,从而出现HBsAg 抗原性的改变。发生于YMDD 区的变异会相应地引起表面抗原多肽195 和196 位氨基酸的变化,但由于该突变区位于具有免疫保护作用的HBsAg 决定簇2a 决定簇的外面,因此,YMDD 区突变对HBsAg 介导的免疫应答影响不大。但其他部位的基因突变却有引起免疫失败的可能性,如多聚酶F512L 与V519L 的变异会相应地引起HBsAg 的A157D、E164D 的改变,HBsAg 的这两处变化正好位于其亲水区,与HBsAg 介导的免疫清除关系密切,该处突变有可能导致“中和反应逃避”。类似的情况也出现于用高效价抗2HBs 免疫球蛋，famciclovir 等治疗乙肝的过程。所以,在抗HBV 治疗的同时,也应设法降低其耐药毒株的出现率,尤其是尽量防止“免疫逃避”变异毒株的出现。
5 YMDD发生变异的两种机理
第一种是诱变学说,即在拉米夫定的作用下HBV 出现新的变异株。有文献报道,YMDD 变异以YVDD最多,其次为YIDD、混合变异。第二种是优势选择学说,即感染个体同时存在原型毒株(YMDD) 和不同的变异毒株群体(YIDD、YVDD) ,在治疗过程中原型毒株受拉米夫定抑制,而使变异毒株逐渐成为优势毒株。事实上大家目前喜欢用优势选择学说来解释这种现象，因为病毒变异是不断存在的，在还没有应用拉米夫定之前，变异株作为弱势株存在，而野生株作为优势株，应用药物之后，变异株存在生存优势，就被选择成为优势株，而这种选择并是一定都会降低病毒致病力。
拉米夫定治疗过程中出现病毒的变异格外受到重视，是因为拉米夫定对病毒的抑制作用下降，耐药株的大量出现，甚至临床病情的反复或加重。也许这都可以用YMDD变异来解释。但别望了，自然界中也存在YMDD变异株，更何况病毒在乙肝的发病机理中仅起到始动因子的作用。也许我们不应该把目光紧紧放在拉米夫定治疗过程中乙肝基因出现了多少位点的变异，更多的应该是研究变异的病毒到底怎样激发了机体的免疫反应。拉米夫定相关的变异一定与耐药有关吗？拉米夫定长期的应用是否具有激发机体的免疫的作用？
。 三）拉米夫定耐药与临床结局
随着对拉米夫定抗HBV 研究的不断深入,人们发现在长期服用拉米夫定过程中,当HBVDNA 阴转后,部分病人血中HBV 可重新出现反跳,这一现象最初是在原位肝移植并实行免疫抑制治疗的患者中发现的 。由此,人们开始认识到,长期应用拉米夫定可诱发HBV 病毒耐药。如果拉米夫定长期应用( > 6 个月) 过程中部分病人出现:一种是HBV DNA由阴性转为阳性,并重新上升至治疗前水平称为复发;另一种是HBV DNA 始终维持在可检测水平以上,表现为对药物不完全应答。加大剂量对疗效无明显影响。此时通常认为产生了HBV耐药株。
1 HBV YMDD 变异导致拉米夫定耐药的分子机制
拉米夫定治疗慢性乙型肝炎耐药性的产生目前研究认为与HBV聚合酶P基因(尤其是YMDD)变异有关，但为何P 基因变异会导致HBV耐药仍不清楚，拉米夫定的无应答真的与变异有关？？然而目前研究普遍认为拉米夫定与HBV 多聚酶逆转录酶结合位点的结合部分由第552 位核苷酸残基组成, 而拉米夫定与逆转录酶的亲和力与RT 区YMDD 基序中第552位氨基酸侧链的长度有关。HBV 野毒株的YMDD 部位呈缓和口袋形, 正好与核苷酸及拉米夫定结合, 但YMDD 变为Y IDD 和YVDD的变异则使侧链长度变短, 引起具有催化活性的YMDD 区发生空间构型的改变, 影响和限制拉米夫定与HBV 逆转录酶结合, 于是拉米夫定抑制HBV DNA 复制的作用下降, 变异之HBV 对拉米夫定产生了耐药性。但有学者提出不同观点, 认为HBV YMDD 基序发生YVDD 或Y IDD 变异后, 聚合酶对寡核苷酸的结合具有了选择性, 变异病毒能区分dCTP 与其类似物拉米夫定, 只能结合dCTP 而不能结合拉米夫定, 使HBV DNA 链能继续合成, 拉米夫定不能抑制YMDD 变异的HBV DNA 的复制。一种新的变异类型，即YSDD变异或rtM204S变异，体外转染研究也证实了这种YSDD变异株对拉米夫定耐药。到底是YMDD基序的变异导致了耐药，还是在其它位点变异的基础上导致了变异，目前确实不太清楚。
2 拉米夫定耐药的可能的影响因素
亚洲的临床研究数据显示，拉米夫定治疗1～4年的基因耐药率分别为14%、38%、49%、66%，提示时间是拉米夫定耐药的首要影响因素。此外，研究表明治疗前HBVDNA和ALT的水平，免疫状况可能是影响耐药的另一个因素。有研究认为HBV对拉米夫定耐药似乎不取决于基因型别，但与HBV/B亚型有关，HBV/B、C基因型HBeAg不同状态LAM耐药发生率不同。至于性别，年龄，种簇，剂量似乎无关。
3 拉米夫定耐药与临床结局
拉米夫定出现耐药后HBVDNA持续阳性或阳转，可以出现ALT的升高，部分病例出现严重肝炎或肝功能失代偿。但并非所有的拉米夫定耐药都出现临床表现。目前越来越多的研究表明YMDD突变HBV DNA反跳引起肝炎活动可能与YMDD以外的突变有关，有待于更多的研究。根据乙肝的发病机理，到目前为止，我都不太关心拉米夫定治疗乙肝中出现变异的多和少，有或无，我想大家更多的应该去探讨变异株怎样激发了机体的免疫反应。既然YMDD突变后HBV DNA反跳不一定都引起肝炎活动，变异后是免疫还是病毒直接损伤好像已经有了答案。 对拉米夫定耐药致肝炎急性发作的理解，应从HBV感染的免疫致病机理包括宿主的免疫因素和病毒的复制。慢性HBV感染者常显示抗病毒T细胞免疫的低反应性。在发作前可先观察到一个高的病毒滴度，接之可激活抗HBV细胞免疫反应，此免疫反应直接针对感染的肝细胞，导致肝细胞坏死和临床肝炎表现。当体内耐药变异株增多，复制增加时，也可激发机体免疫反应引起临床肝炎的突发。若强有力的免疫反应能控制病毒的复制，则结局是病毒清除(eAg转换，HBV DNA消失)和疾病恢复。如果免疫反应不足以消灭病毒，则肝功能可持续异常。因此拉米夫定长期治疗后YMDD变异株发展后，内在的细胞免疫反应也决定了是否发生肝炎发作及其肝损害的程度。变异后肝功能的异常是否和干扰素治疗中出现的肝功能异常一样，提示着更高的e－AG转换？所以拉米夫定耐药与临床结局之间的关系问题可能需要更多时日来解释。 四 苷类似物耐药的检测方法与监测意义
临床发现细菌感染进行药敏试验，根据药敏结果选用抗生素已是习以为常工作。然而，临床上如何监控HBV耐药毒株的产生？药敏检测模式如何？等均是我们面临的新课题。随着多种抗HBV核苷类似物的临床应用，如何监控HBV核苷类似物耐药性的产生以减少医疗经济损失，如何组织和发展核苷类似物HBV耐药性监测计划，并指导各级医院和国家的抗HBV药物管理。这些问题已成为临床医师关注的焦点，研究HBV耐药性对治疗效果的影响可能有重要的临床价值。
4 1 检测HBV YMDD 变异的意义。拉米夫定因其抑制HBV 效果明显、使用方便、患者对其耐受性好而在乙肝病人的抗病毒治疗中被广泛应用。但是在长期应用过程中,HBV 可发生变异而对拉米夫定产生耐药性, 抗病毒疗效随之降低。部分患者使用拉米夫定治疗超过半年以上即发生耐药, 耐药一旦发生, 抗病毒疗效将降低为原来的万分之一, 因此对正在使用拉米夫定治疗的乙型肝炎患者进行HBV YMDD 变异的检测显得十分重要, 这有助于监测肝炎病情、评价抗病毒治疗的效果及调整治疗方案。
4. 2 HBV YMDD 变异的检测方法。虽然目前有很多方法，但目前缺乏公认的检验方法，这也许是最近发现越来越多的位点变异的原因之一吧。所以探讨合适的检验方法也是当务之急。
4. 2. 1 测序检测HBV YMDD 变异。设计特定的上、下游引物, 对HBV P 基因中YMDD 基序编码基因及其附近基因序列进行PCR 扩增, 用测序仪测定扩增产物的核苷酸序列, 之后确定P 基因第739 位的核苷酸碱基有无发生腺嘌呤变成鸟嘌呤的变异(A →G) 及第741 位的核苷酸碱基有无发生鸟嘌呤变为胸腺嘧啶的变异(G→T ) , 从而鉴定YMDD 变异。HBV YMDD变异的测序有PCR 产物直接测序和PCR 产物克隆后测序。由于测序过程繁琐、费时、费力, 此方法不适于临床大规模开展。
4. 2. 2 用PCR RFL P 方法检测HBV YMDD变异。设计错配引物, 用PCR 方法对HBV P 基因C 区包括YMDD 基序编码基因的一段核苷酸序列进行PCR 扩增, 引物中引入了针对突变位点的限制性内切酶酶切位点, 扩增产物用相应限制内切酶酶切并行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用RFL P 原理分析酶切产物, 鉴定HBV YMDD变异株。用PCR RFL P 方法检测HBV YMDD 变异快速、简便、灵敏、经济, 适合临床大规模开展。
4 2 3 用L igh tcycler 探针杂交法检测HBV YMDD 变异。原理是将两种探针分别与HBV野生型和HBV YMDD 变异株P 基因C 区的相应核苷酸序列进行杂交。这两种探针所针对的HBV 多聚酶C 区YMDD 基序编码基因的核苷酸序列不同, 它们分别与相应的HBV 野生株和YMDD 变异株多聚酶C 区编码区的核苷酸杂交融合后所形成的杂交融合曲线在分子动力学上存在差别, 通过此差别可区别HBV 的与拉米夫定耐药表现型有关的单个碱基的变化, 从而区别出HBV 野生型与HBV YMDD 耐药变异型。但L igh tcycler 方法所需设备和试剂均十分昂贵,限制了其普及应用。
4. 2 4 用线性探针(L ine p robe assay L iPA )检测HBV YMDD 变异。
4. 2 5 用基因芯片检测HBV YMDD 变异。设计相关引物, 扩增出包含有HBV YMDD 变异区在内的核苷酸片段。针对YMDD 变异位点设计探针, 将探针固定在经过特殊处理的载体(玻片等) 上, 并且与待测血清中经用PCR 法扩增并标记的HBV DNA 杂交, 经过洗脱后在微阵列扫描仪上扫描, 用专门的软件分析确定HBV YMDD 变异的类型。基因芯片技术是近年来发展起来的高效分子诊断技术, 用基因芯片法检测HBV YMDD 变异快速、重复率高,不仅能检测出多个位点的HBV 变异, 而且能检测出野生株与变异株共存的混合感染, 在临床上具有很大的应用前景。
HBV DNA定量检测与测序和PCR-RFLP可用于监测体内HBV动力学变化；阐明药物诱导HBV突变的确切生物学意义，需将耐药突变体转染培养细胞系，进行体外病毒药敏实验。
随着拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎临床使用的推广,将出现大量需要进行耐药性基因变异检测的病例,为适应临床大样本检测的需要,发展新的成本低,技术要求相对简单,适合临床大样本检测的方法显得尤为重要。目前,检测乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异的方法,主要采用基因测序分析进行。测序虽可发现多位点的变异,但操作复杂,需要数个工作日,易发生测序失误。此外,测序技术要求高,所需仪器、设备较为昂贵,一般医疗机构难以承受,也不适合较大样本的分析, 线性探针,light2cycler 技术等,仍存在高成本等问题,应用有其局限性。
目前对YMDD变异的研究在方法上由以下不足1)在检测变异时多数仅检测一段序列，对拉米夫定治疗后整个HBV序列的了解不够。2）即使研究了整个序列，得到的基因序列也是拼接而成，不能完全代表人体内HBV基因序列3）在研究YMDD基序和YMDD基序外变异对病毒复制力的影响时目前主要采用了人工体外诱变的方法，不能完全反映在拉米夫定的选择性压力下，人体内自然出现的变异株的生物学特性。今后有必要直接从患者体内扩增，克隆HBV全基因，在HBV基因组水平上研究拉米夫定治疗前和变异后的复制特性。
拉米夫定和阿德福韦的相继上市，将为我们提供新的抗HBV药物选择。然而，我们必须高度重视这些药物的耐药性，应尽早出台我国的抗病毒药物使用政策，形成全国各级医院参与的耐药监测网络，并选择几所中心城市大医院成立标准化的病毒耐药监测中心，定期通报HBV耐药研究情况。国内外专业人员（含管理人员）应定期开会讨论耐药研究方面的使用。制定严格的抗病毒药物使用制度，必须有合格专科医师的处方，上级医师对处方的审核，才可开始抗HBV治疗。同时应严格掌握卫生部批准的使用适应症。对于慢性无症状携带者不宜盲目急于使用核苷类似物进行抗病毒治疗。
虽然病毒变异与临床的关系还没有完全阐明，但我们也的确应该高度重视拉米夫定治疗中的变异现象。如果有一天乙肝病毒对目前的药物都产生了耐药，我们的确不敢想象。 五 YMDD耐药变异的防治
对于拉米夫定治疗过程中出现YMDD耐药变异的处理，拉米夫定治疗共识里有较详细的意见，不再重复。
随着用药时间的延长，拉米夫定易引起病毒变异，导致耐药。为了减少耐药性的出现，一方面可以联合用药。
从理论上讲，IFN和核苷类药物在不同的靶位点联合应用，可减少耐药株的出现。但对此也有相反意见，在美国、加拿大、欧洲进行的IFN和拉米夫定联合治疗疗效也不佳。
有人报道，对拉米夫定耐药株M552I变异可用拉米夫定－FAM序贯治疗可抑制病毒复制，但不同意见者认为拉米夫定在P区也可出现L528M变异，该药所出现的P区其他突变V521L、P525L、W501E等，亦可引起肝炎突发。
阿德福韦（ADV）是一个广谱的抗病毒药物。在HIV治疗过程中未发现有耐药变异。对于YMDD变异导致急性发作和病情急剧变化是否继续应用拉米夫定，一般认为拉米夫定对野毒株继续有效，应继续用药，但在拉米夫定变异株产生病情急剧变化，当SB>50umol/L时应考虑停药并改用其他抗病毒。在治疗策略上，可针对HBV复制过程的不同靶位点，开发新的药物，并设计联合或序贯治疗。
对于拉米夫定治疗过程中出现YMDD耐药变异后可以再次应用干扰素治疗。
对于拉米夫定治疗过程中出现YMDD耐药变异后拉米夫定继续应用的问题现在有些争论，有人认为续用无效。
防止耐药性产生的途径
从耐药株产生的分子机制的角度选用不同的核苷类似物联合或者发展新的核苷类似物,选用需多位点变异才能导致耐药的药物是未来乙肝治疗的趋势。
总之,核苷类似物的发现是治疗乙型病毒性肝炎的一大突破,有望成为彻底治愈慢性乙型病毒性肝炎的手段,但长期用药过程中耐药性的产生妨碍了其临床应用。研究拉米夫定治疗中病毒变异问题对研究耐药性的产生有重要的临床意义,同时有助于明确HBV 逃避抗病毒药物的机制。以拉米夫定和阿德福韦为代表的核苷类似物将是今后乙肝治疗的重点药物，对其应用中的变异与临床的关系的研究，有助于弄清乙肝的发病机理，为彻底消除乙肝带来希望。对拉米夫定相关性变异与临床关系的探讨也有利于指导其它已开发或正在开发的核甘药物的应用。随着研究的深入，可以预见的是未了避免耐药的发生多药联合治疗乙肝是必然趋势，但需弄清的问题越来越多，联合一定有效吗？怎么联合？开始治疗最佳的联合方案？治疗的终点是什么？……也许乙肝治疗过程中我们遇到的问题会越来越多，但我们也应该更清楚离攻克乙肝的路也许也越来越近。参与的人越多，我们的力量就越大。发表您治疗乙肝的体会吧，也许真理就在您的智慧里。 拉米夫定相关性HBV变异位点的命名的说明
拉米夫定相关性HBV变异多位于HBV聚合酶的RT区。过去，HBV Pol氨基酸序列的位置命名是从P基因的起始密码子开始的。由于不同基因型P基因编码的Pol氨基酸长度不一致，导致HBV Pol氨基酸位置的命名一直较为混乱。如A基因型HBV的P基因编码845个氨基酸，而B和C基因型的P基因编码843个氨基酸，D基因型的P基因编码842个氨基酸。这样就导致了同一个氨基酸在不同的基因型中的命名位置不一致，不利于相互交流。如YMDD基序中的M，在A基因型中位于552位，而在B和C基因型中为550位，在D基因型为539位，在E和G基因型为549位。为了消除这种基因型之间的差异，有学者重新对Pol进行了命名，命名原则如下：不同的HBV毒株P基因TP(末端蛋白)和间隔区在不同基因型中长度不一致，而所有HBV毒株的RT区长度均为344个氨基酸，并起始于一个保守序列EDWGPCDEHG。基于这样一个特点，对Pol RT区进行单独命名已成为可能。例如;基L528M因A ，B/C/F/H，D，E/G在RT的B区中与FCV,LAM相关的变异L528M，L526M，L515M，L525M均为L180M，与LAM相关的变异M552V/I，M550V/I，M539V/I，M549V/I均为M204V/I。 飞跃2004的发言概括的很全面，看过以后，受益匪浅！
拉米夫定是HBV复制强有力的抑制剂，能够与HBV DNA多聚酶YMDD (酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) 基序特异性结合，从而起到抑制病毒复制的作用。拉米夫定可明显抑制HBV的复制，进而达到控制炎症、稳定病情甚至阻止肝纤维化的进展，但对肝细胞内cccDNA无直接作用，因此停药后易于复发，需要长期用药。但随着用药时间的延长，在药物和人体免疫选择压力下，可能产生耐药. 体内外研究均已表明，拉米夫定耐药主要是由HBV P基因C区YMDD变异所引起. YMDD变异分为两种，一种是HBV P基因第550位氨基酸由蛋氨酸(methionine，M)突变为缬氨酸(valine，V)，此乃YVDD变异，同时伴有528位的突变(核苷酸A669→C，使氨基酸由亮氨酸528→蛋氨酸); 另一种是HBV P基因第550位氨基酸由M突变为异亮氨酸(isoleucine，I)，此乃YIDD变异. 这两种变异分别由HBV第739位碱基A→G和741位G→T突变所引起. 一旦出现YMDD变异株，对拉米夫定不再敏感。耐药可能会伴有HBV DNA定量反跳和肝功能变化，甚至导致病情恶化。因此在出现YMDD变异株后要密切监视患者病情变化，包括肝脏功能、HBV DNA定量等. 如出现ALT明显升高，临床症状加重，则应停药. 新出现的一些核苷类似药物如阿的福韦，对YMDD变异株仍然有效，上市后可以作为治疗这种变异株的有效药物。
今天时间有限，就拉米夫定抗病毒过程中的机体免疫功能变化提出个问题，也供大家讨论
首先：拉米夫定作为核苷类的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物，其抗病毒的机制主要是抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及DNA链延伸过程中起到链终止作用来抑制HBV复制。但就目前的文献来看，很多单位都已经提出拉米夫定治疗后CHB患者体内免疫指标的变化。
那么：这种变化来自何处？是由于HBV感染引起机体免疫功能变化，经过拉米夫定治疗后由于HBV滴度下降，免疫力的自然恢复；还是由于药物本身具备免疫调节的能力（理论上拉米夫定没有这样的功能，如果给正常人群应用拉米夫定后观察体内免疫指标变化，应该有更确切的结论，但我还没见过相关的文章）？如果是前者，CHB患者机体免疫力下降是HBV慢性携带的因还是果，抑或哪个占主导地位？
第三：拉米夫定治疗后YMDD变异后机体免疫功能的变化又是如何？出现拉米夫定变异后肝功反复或重型肝炎的免疫机制与未应用拉米夫定的CHB患者出现上述表现的机制是一样吗？ 拉米夫定在临床已得到广泛应用，然而,拉米夫定不能彻底清除HBV 的 ccc DNA 复制模板,长期应用会发生HBV变异的问题越来越突出地暴露出来,部分患者出现HBV DNA阳转、ALT升高,甚至黄疸,少数患者演变为重型肝炎或病情恶化 。
1、拉米夫定致HBV变异对肝功能影响
拉米夫定相关性YMDD 变异成为一个突出问题,一些患者耐药后发生肝功能反跳,甚至出现暴发性肝衰竭。Mutimer等报道 ,发生拉米夫定耐药后血清中检出高滴度HBV 变异株,并很快发生肝衰竭,
Liaw 等研究显示 , 变异发生后93.7 %患者血清ALT升高,40. 6 %患者变异发生后4 周～94 周(中位数:24 周) 发生肝病的急性加重。
意大利有报道分析591 例HBeAg 阴性的CHB 患者,依病情分3 组,其中CHB331 例、肝硬化Child A 组184 例和C 组76例,平均服用拉米夫定24. 7 个月。结果在治疗应答的558 例中,198 例(35. 5 %) 于平均19. 6 月后出现YMDD 变异,3 组之间无差别。在出现YMDD 变异后或因此而停药者中,106 例共发生142 次重要不良反应事件,包括ALT 大于正常值10 倍、肝癌、肝脏失代偿、肝移植和死亡等,其发生率在CHB 为6. 3 %、Child A 级22. 8 %和C 级56. 5 %。可见原有肝硬化者当发生耐药变异或停药后,较易出现严重的肝脏失代偿。
美国和亚洲的研究指出 ,长期拉米夫定治疗可使肝组织等病变进步,但如出现YMDD 变异伴有病毒学和生化指标的复发或反跳,组织学的改善可退步或丧失,伴有病情加重或恶化或发生肝并发症(肝衰竭、肝癌、死亡) 的危险性很高。
2、YMDD 变异后的对策
目前认为,发生变异不一定产生耐药,只有当变异株成为优势株时才可能出现耐药,变异不一定停药。一般认为,多数YMDD 变异患者,继续服用拉米夫定,可提高HBeAg 的血清转换率,改善肝脏组织学。推测可能与YMDD 变异后,可诱导机体对HBV 免疫反应的重建,激活机体清除HBV 的反应有关。Perrillo 等认为,停用拉米夫定会造成野生株再度成为优势株,使肝功能出现反复及恶化。 同意飞跃2004的观点.并很有收获.
YMDD 变异确实比较麻烦,但在临床上我们一般来说并不主张停用拉米夫定,除非有条件用阿德福韦,或加用干扰素.
有的病人用拉米夫定后ALT明显上升,但HBV-DNA却不高,或HBV-DNA升高,ALT却是正常的,检查并无YMDD 变异,只有继续用YMDD 了.
现在让病人服用拉米夫定也比以前困难了,有的病人已把拉米夫定当成了"毒药".有的病人用阿德福韦后却出现TBILI及ALT上升,又住院治疗(当然没敢停阿德福韦),也不知阿德福韦在临床大量应用后又有什么,只希望不要有拉米夫定类的麻烦,据说恩替卡韦这药不错,可惜没用过.
我很想听听YMDD 变异后停用拉米夫定,而未用阿德福韦的各位在临床治疗中的经验.我在临床治疗中却见有的病人停用拉米夫定后病情恶化,只有又加用拉米夫定或用可耐,阿糖腺苷并护肝治疗,停用拉米夫定真难!!不知各位专家在没条件用阿德福韦的情况下还有什么好方法.谢谢 上面各位战友的内容都很精彩，本人的临床经验较少，就接触到的一些问题和情况简单谈一下，内容若有不当之处，还望各位主任见谅并给予指正。
1.虽然拉米夫定目前在临床已得到广泛应用，在中国大陆已上市5年有余，但当前仍有许多地方的医生在给患者应用此药时不考虑适应症（即在ALT正常的病毒携带者中使用），不知是因为缺少这方面的知识还是出于其它目的，导致这些患者最后骑虎难下；
2.拉米夫定耐药变异的问题也“吓坏了”越来越多的医生和患者，导致一些医生在患者适合抗病毒治疗时也不敢推荐拉米夫定，而患者坚决拒绝使用；同时因经济原因和干扰素的副作用而只“保肝”治疗；
3.对于拉米夫定耐药变异的检测，虽说目前方法较多，但没有统一的标准，每种方法各有利弊，而且即使有部分变异有的方法也检测不出来。我曾经对一份标本用不同的方法进行检测，结果有的检测有变异而有的报告无变异，即使用同一种方法（如基因测序），不同的检测者也有不同的报告（我亲眼见过）。这样，就给临床医生造成了影响，因为可能会作出错误的判断而对患者造成心理和经济等负担，同时还可能影响最终治疗；
4.病毒本身具有变异特性，在抗病毒治疗的压力下更易产生，随着拉米夫定使用的增多和广泛，长期应用拉米夫定是否出现其它新的变异还不清楚；
5.澳大利亚的两个学者研究发现：拉米夫定相关HBV变异株HBsAg与抗HBs的结合力明显降低，尤其是当伴随“a”决定簇内变异时，HBsAg与抗HBs的结合力的降低更明显。当HBsAg与抗HBs的结合力明显降低时，可成为免疫逃避变异株，导致乙肝疫苗接种失败。而我国每年有大量乙肝患者服用拉米夫定，是否会产生HBsAg “a”决定簇内变异，以及这种变异株是否会发生免疫逃避而导致乙肝疫苗接种失败，也是一个急需阐明的问题。 大家说得都很全面,说起贺普丁,我也把临床工作中遇到的问题向大家聊聊.
1.自贺普丁于我院应用7年来,它的问世给广大患者带来了福音.其抗病毒作用是相当迅速的,HBV_DNA最快2周即可转阴.相继GPT复常,但是血清转换率却是比较低的.大部分病人服用1年半,仍未出现血请转换.迟迟不能停药.当然我们选择的病人都是符合抗病毒指征的.
2.即使1年半后出现血清转换,符合停药指征的,大部分停药后仍然出现HBV-DNA转阳,GPT复升,无奈之下只好选择其他的抗病毒药物.
3再有一部分病人在用药过程中既出现YMDD变异,我们遇到一例病人最早6个月既出现YMDD变异,只好联合其他抗病毒药物,待病情稳定后,停用贺普丁.
4经过一段时间贺普丁的应用,喜忧参半,早期应用效果确实不错,而后期的麻烦确实不少,这也是病人"谈虎色变'的原因.虽然贺普丁有诸多弊端,但在控制病情方面却是功不可没.
5正因为贺普丁的以上缺点,近几年来我院在贺普丁联合治疗方面作了很多临床实践,其中贺普丁联合干扰素治疗取得了很好的效果,当然前提是符合抗病毒条件,干扰素500万U肌肉注射/天,连续15天后,改为隔天肌肉注射,疗程半年;同时配合贺普丁100MG,一天一片,疗程一年半.二者联合治疗大大提高了血清转换率,降低了停药反复率及用药过程中的YMDD变异率.目前我们的病人可以说100%出现血清转换,无一例YMDD变异,正在停药观察之中.当然我们的病例不是很多,但是我们正在积极的多病例观察.
以上是本人工作中应用贺普丁的点点体会,有不到之处望同任们指教. 飞越2004:人们在探索着。也许沿着这条路继续走下去，乙肝的彻底有效的治疗就在不远的那一天。但同时我们也应该冷静的思考一下，我们没有在做无用功吧，毕竟病毒的变异是病毒进化的基本特性之一，所谓的各种病毒靶点的变异真的有生物学意义吗？？
人类在与自然界的斗争中，从来不是绝对的胜利者，个人认为：抗生素的耐药现状应该是抗病毒药物明天的前景，现在的抗病毒药物研究，虽不能说没有意义，也不能片面的夸大其意义，把治愈乙肝的希望完全寄托在新的抗病毒药物的身上，或许会在明天让我们失去更多。
既然消灭乙肝病毒在短期内是不可能的事，那么防治上策就是御敌于国门之外，采用各种办法提高机体的免疫能力（特异或非特异），使机体不感染或者感染后迅速自发清除病毒；中策是如果不能防御，那么就不要去刺激病毒，转而抗肝脏的慢性炎症，延缓其进展为肝硬化，达到机体与病毒长期和平共处；至于使用抗病毒治疗，从拉米的临床应用来看，是不得已而为的类似饮鸩止渴的下策。
从以前的经验和拉米应用的现状看，治疗乙肝的希望不在抗病毒药物身上。
如同我们期待后抗生素时代的来临一样，我们现在努力的方向，应该很大一部分从抗病毒转到后抗病毒时代这方面来。
风物长宜放眼观，说得有些离题，也是对拉米的不尽如人意的一些反省吧。 新手上路，3TC临床体会不深刻，个人拙见，错误之处请指正！
1。YMDD突变后HBV DNA反跳是否引起肝炎活动？
一般认为YMDD突变后HBV DAN反跳引起肝炎活动。YMDD变异株在转染细胞系中的复制活性低于野毒株，然而对LAM敏感性降低1000~10000倍。临床上，随着血清YMDD突变株的出现，HBV DNA可重新回升，部分病人出现肝炎急性发作，甚至肝功能失代偿。
2。YMDD突变HBV DNA反跳引起肝炎活动是否与YMDD以外的突变有关？
在台湾对23例出现接受拉米夫定治疗中出现YMDD变异的病例进行了更长时间的治疗随访研究，收集了系列标本，随访结束时7例为A529T突变，6例为L528M/M5501I突变，1例为上述两种突变株的混合感染。通过体外定向突变技术证实A529T突变和L528M/M550I突充均为耐LAM毒株。有18例病人在随访过程中出现了耐药突变株类型的变化（包括M522I、L526M/M552V、混合感染及新出现的耐药突变株等），其中15例出现了肝功能的改变，后者11例ALT水平上升达5倍正常值上限，出现ALT上升的同时多数都伴有HBV DNA定量水平的升高。因此认为体耐药突变株类型的变化引发肝功能和改变和HBV DNA定量的改变，可能是由于机体免疫清除原有突变株的过程所引起。新出现的耐药突变株逐渐转变为优势株，又引发机体的免疫清除，引起肝炎活动。
另外：治疗期间发生YMDD突变后病人临床表现形式多样。······。部分病人可无临床症状、ALT正常，类似免疫耐受；
请教前辈：这种情况下我们的治疗如何选择？如已经停用3TC，是暂时不用药密切观察还是积极采取针对YMDD变异株的治疗呢？ 灯红酒绿 wrote:
2、YMDD 变异后的对策
目前认为,发生变异不一定产生耐药,只有当变异株成为优势株时才可能出现耐药,变异不一定停药。一般认为,多数YMDD 变异患者,继续服用拉米夫定,可提高HBeAg 的血清转换率,改善肝脏组织学。推测可能与YMDD 变异后,可诱导机体对HBV 免疫反应的重建,激活机体清除HBV 的反应有关。Perrillo 等认为,停用拉米夫定会造成野生株再度成为优势株,使肝功能出现反复及恶化。
同意这种观点,多数YMDD 变异患者,继续服用拉米夫定,可提高HBeAg 的血清转换率,改善肝脏组织学.由Chien-Hung Chen1, Chuan-Mo Lee等发表在Journal of Hepatology 41(3)上的一篇文章也说明了这个问题,在这篇文章中作者采用对照的方法,比较发生YMDD 变异后持续应用拉米夫定与中断拉米夫定治疗,对患者的影响,结果前三个月,两组观测指标没有统计学的意义,在第四个月后,中断拉米夫定治疗的的患者与持续拉米夫定治疗的患者相比增加了恶化和ALT锋值的发生率。 北京大学第一医院 斯崇文
ＨＢＶ感染呈世界性流行，全球发病人数约３．５－４亿人。我国是高流行地区，根据１９９２－１９９５年的全国血清流行病学调查，ＨＢｓＡｇ阳性流行率为９．７５％，约１．２亿人携带ＨＢｓＡｇ；慢性乙型肝炎病人约为２０００－３０００万例，其中约１０％～２０％可发展为肝硬化；肝硬化病人中，每年约有１％～４％发生肝细胞癌；慢性乙型肝炎是我国肝硬化和肝细胞癌的主要病因。每年约２５～３０万人死于乙型肝炎相关性疾病。而且，还可通过母婴传播传给婴幼儿，使其成为慢性ＨＢＶ感染者，常成为终身感染，严重危害下一代人的健康。因此，ＨＢＶ感染是极为重要的公共卫生问题。２００５年由国家确定，将慢性乙型肝炎与艾滋病、结核病和血吸血病一起列为我国四大重点防治的传染病。
治疗目标
慢性乙型肝炎治疗的目标是什么？应是持续抑制ＨＢＶ复制，从而减轻和防止肝炎病变加重和复发，减缓和预防其进展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。但最终的治疗目标应是消除病毒和病变停止进展和恢复。
治疗终点
慢性乙型肝炎的治疗终点应符合治疗目标。最终和理想的的治疗终点应是ＨＢｓＡｇ转阴或ＨＢｓＡｇ血清转换?血清ＨＢｓＡｇ阴性，抗ＨＢｓ阳性?，此类病人表现为持续性ＡＬＴ正常和ＨＢｅＡｇ血清转换、肝组织病变轻度或恢复正常，血清ＨＢＶ ＤＮＡ阴性，肝组织中无游离ＨＢＶ或少数病人有少量ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ，提示ＨＢＶ趋向消除或已经消除。但目前的抗ＨＢＶ药物和方法很少能达到这样的治疗终点，可能需要很长时期的治疗。因此，目前实用的临床治疗终点，对于ＨＢｅＡｇ?＋?慢性乙型肝炎病人，应是ＨＢｅＡｇ血清转换?伴有血清ＨＢＶ ＤＮＡ＜１０5拷贝／ｍｌ、ＡＬＴ恢复正常。目前，多数学者认为，ＨＢｅＡｇ血清转换是抑制ＨＢＶ复制和肝组织病变好转的标志。但亦有报告，在拉米夫定治疗出现ＨＢｅＡｇ血清转换后，持久应答率?ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ?差别很大，为３８％～７７％。３年累积复发率为３６％～５４％。因此，出现ＨＢｅＡｇ血清转换后，至少须继续治疗半年～１年。对ＨＢｅＡｇ?－? 慢性乙型肝炎病人，则不能用ＨＢｅＡｇ血清转换作为治疗终点，而是ＨＢＶ ＤＮＡ＜１０4拷贝／ｍｌ，（ＨｂｅＡｇ阴性慢性乙型肝炎病人的血清ＨＢＶ ＤＮＡ复制水平较低且波动较大），ＡＬＴ恢复正常，疗程至少１年。
治疗策略
慢性乙型肝炎是一种难治性疾病。目前对慢性乙型肝炎的治疗，应采用综合治疗方法：抗病毒、免疫调节、抗炎和改善肝功能和抗肝纤维化治疗，而抗病毒是主要和关键治疗。目前公认有效的抗病毒药物是α干扰素（包括Ｐｅｇ－α干扰素）、核苷类似物和免疫调节剂，如胸腺肽α１?ｔｈｙｍｏｓｉｎ α１?等。但目前抗ＨＢＶ治疗的疗效还不满意，不能彻底清除病毒。其原因很多：如目前的抗ＨＢＶ治疗仅能抑制病毒复制，ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ难以消除，产生免疫耐受?ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ?，ＨＢＶ是一种易变异病毒，可产生耐药而影响抗病毒药的疗效，此外还有ＨＢＶ ＤＮＡ可与宿主细胞的ＤＮＡ整合，难以消除等因素。但目前认为主要有两种因素：一是ＨＢＶ复制的原始模板——ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ半衰期长，不易降解，目前的抗病毒药不能消除ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ是ＨＢＶ持续复制和抗病毒治疗复发的原因。另一个因素是，患者存在不同程度对ＨＢＶ的免疫耐受，ＨＢＶ不能被免疫清除，长期甚至终身在体内存在及复制。
如何清除ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ？目前认为有两种策略：①通过有效的、长疗程抗ＨＢＶ药物治疗，可长期、明显抑制ＨＢＶ外源性感染?ＨＢＶ不断感染肝细胞?和内源性复制?ＨＢＶ在细胞内不断复制?，可持续减少和阻断对ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ库的补充，最后达到耗竭的目的。②打破免疫耐受，消除免疫耐受，提高人体免疫功能，尤其是特异性细胞免疫功能，通过细胞溶解机制和非细胞溶解机制，消除细胞内、外的ＨＢＶ，包括ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ，这是根治ＨＢＶ十分重要的治疗措施。但由于免疫耐受的机制迄今尚不清楚，目前尚无有效治疗方法。而免疫耐受的机制和程度，个体差异很大，治疗效果亦不同。到目前为止，尚无针对免疫耐受有效的特异性免疫治疗，各种治疗性疫苗尚在研究中。研究ＨＢＶ感染的免疫耐受机制，虽然难度很大，但这是治疗ＨＢＶ感染的根本措施，应加强研究。
如何采用长期有效的抗病毒治疗？近年来，高效、低毒的抗ＨＢＶ药不断增多，为有效治疗慢性乙型肝炎创造条件。单一抗病毒药如α干扰素，尤其是Ｐｅｇ－α干扰素疗效优于α干扰素，每周注射１次，使用方便，因其有免疫调节作用，常有治疗后效应?ｐｏｓｔ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ?，易获得持续疗效?不产生耐药性。新的核苷类似物不断出现，抗ＨＢＶ疗效快而强，适应证较广，不良反应少，可以口服，使用方便。
但单一抗病毒药如α干扰素须注射治疗，不良反应较大，不宜用于失代偿期和白细胞及血小板明显减少的肝病患者。而核苷类似物疗程难以确定，长期治疗均可产生耐药突变?ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ?而造成耐药，引起治疗过程中病情反弹?ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ?，可使病情恶化?不宜于长期治疗。
近年来，国内、外学者采用以下治疗方法：①联合治疗：是否可以提高抗ＨＢＶ的疗效？到目前为止，尚无肯定有效的联合治疗。但联合抗ＨＢＶ不同作用靶位和机制的药物，可能会产生抗ＨＢＶ的协同作用。但选用何种药物联合？如何联合？其耐药性和不良反应等，尚须进一步研究。而且联合治疗药费较贵，是否符合药物经济学原则，有待进一步研究。②序贯治疗：是把有效的抗ＨＢＶ药连续、交替和顺序治疗。可以长疗程、有效地抗ＨＢＶ，防止病毒耐药突变和减少药物不良反应。尤其是新的有效的抗ＨＢＶ药不断研制和临床应用，为序贯治疗创造了更多可供选择的有效药物和良好的治疗条件，符合长期有效抗ＨＢＶ治疗的原则。但应选择哪些有效的抗ＨＢＶ药物？如何进行有效的序贯治疗等等，还须进一步研究。③个体治疗：根据病毒的特点：如ＨＢＶ基因型、病毒变异情况等；病人的个体因素如年龄、肥胖等和免疫状态，对抗ＨＢＶ治疗的应答及耐受性等。个体治疗是减少抗ＨＢＶ治疗个体差异，提高抗ＨＢＶ疗效的有效治疗方法。但影响因素很多而且复杂，尚需进一步研究。
总之，慢性乙型肝炎是一种难治性疾病。目前要彻底清除ＨＢＶ，达到疾病治愈的目标，还有很大的难度。很多问题还有待于研究和解决，如何打破病人的免疫耐受？如何清除ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ？抗病毒药物的治疗终点是什幺？适宜的疗程应该多长？如何控制病毒耐药突变等等，都有待进一步的研究和解决。
转自中国医学论坛报 yytaotao wrote:
就拉米夫定抗病毒过程中的机体免疫功能变化提出个问题，也供大家讨论
首先：拉米夫定作为核苷类的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物，其抗病毒的机制主要是抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及DNA链延伸过程中起到链终止作用来抑制HBV复制。但就目前的文献来看，很多单位都已经提出拉米夫定治疗后CHB患者体内免疫指标的变化。
那么：这种变化来自何处？是由于HBV感染引起机体免疫功能变化，经过拉米夫定治疗后由于HBV滴度下降，免疫力的自然恢复；还是由于药物本身具备免疫调节的能力（理论上拉米夫定没有这样的功能，如果给正常人群应用拉米夫定后观察体内免疫指标变化，应该有更确切的结论，但我还没见过相关的文章）？如果是前者，CHB患者机体免疫力下降是HBV慢性携带的因还是果，抑或哪个占主导地位？
第三：拉米夫定治疗后YMDD变异后机体免疫功能的变化又是如何？出现拉米夫定变异后肝功反复或重型肝炎的免疫机制与未应用拉米夫定的CHB患者出现上述表现的机制是一样吗？
有研究认为，拉米夫定可以重建HBV特异性细胞免疫。在拉米夫定治疗过程中测定T细胞功能时发现，拉米夫定在大幅度降低病毒和抗原数量的同时，可使长期处于对HBV低反应状态的T细胞功能得以恢复。在一组HBeAg阳性、ALT升高单独应用拉米夫定的病例中，观察到拉米夫定可以克服慢性HBV感染状态时CTL低应答状态，使CTL对外源性刺激敏感。在拉米夫定治疗后7～14天，可以测得明显的CD4+T细胞介导的对HBV核壳抗原的反应，这种反应在12例患者中有10例呈持续性，其出现继之以快速且显著的血清病毒水平的下降。伴随着血清病毒水平的下降，拉米夫定治疗后慢性乙型肝炎患者有效的抗病毒T细胞反应可以得到恢复和重建；拉米夫定还可增强T细胞对丝裂原和回忆抗原的反应，说明拉米夫定的效应并不局限于HBV特异性T细胞。 感谢飞越2004 战友主持这么精彩而且与我们临床实际相符的讨论。
拉米夫定自上市以来，已经引起乙肝治疗的巨大变化，早期由于此种药物抑制乙肝DNA快速且副作用小，所以可能有一大批患者，他们可能并不符合治疗标准而进行治疗，这些患者主要是免疫耐受乙肝患者，他们对乙肝病毒处于一种耐受状态，这种患者在长期治疗中很少发生e抗原转换，而s抗原转换也是罕见的，同时我们可以看到干扰素在这种治疗上是有优势的，提示它们的作用机理是不一样的。即病毒只有可能通过免疫系统清除，而不是核甘类似物，因此有人在2003年提出核苷类似物并不是乙肝治疗的希望。所以如果有特异性免疫缺陷的患者，在强大压力选择之下，会发生耐药变异，到目前为止，所有的核甘类似物均有特异的耐药变异，只是发生比率不同罢了，对于这种变异可能我们只能拖延而并不能阻止，这种拖延的办法首先就是联合用药，由于这些药物变异靶点不同，之间没有交叉耐药（LdT和拉米尚未明确），那么可以联合用药拖延耐药株出现，毕竟变异是病毒永恒的旋律，还有就是谨慎用药，在患者没有抗病毒指征时不要轻易使用这些药物，即使患者肝功能不正常，也应该观察一段时间（6个月）决定是否应用这种药物，在给患者选择用药时建议首先还是考虑干扰素，虽然证据表明这些药物疗效基本相同，但干扰素在病毒清除中引发变异少见，并在抗原转阴方面有其优势。
一旦发生耐药变异，首先要确定这种病毒反跳是拉米的耐药变异，因为我们要除外患者依从性不好或服用无效药物引起的反跳，确定之后，我们有以下方法，1、立即停药观察，很多研究表明发生变异以后再继续应用拉米没有什么好处。2、换用阿德福韦，尤其对肝功能flare的患者和失代偿肝病患者，可能不久我们就能够选择恩的卡韦了。3、如果发生黄疸升高，出现肝功能衰竭，早期血液净化治疗对患者可能有益，同时停药并不会影响患者预后。 Treatment of chronic hepatitis B has advanced significantly during the past 15 years as a result of the development of safe and efficacious orally available antiviral nucleoside and nucleotide analogues. The first of these, lamivudine, a synthetic deoxycytidine analogue with an unnatural L-conformation, gained approval from the United States Food and Drug Administration (FDA) for treatment of chronic hepatitis B in 1999, and related L-nucleosides, including emtricitabine, telbivudine, and clevudine, have since progressed to late-stage clinical trials. Adefovir dipivoxil, a prodrug for the acyclic dAMP analogue adefovir, gained FDA approval in 2002, and clinical trials of structurally similar tenofovir disoproxil fumarate, which is currently used to treat HIV infection, are underway.[1] The most potent anti-HBV drug discovered to date is the deoxyguanosine analogue entecavir, which has recently been recommended by the FDA Antiviral Drugs Advisory Committee for approval for first-line use against HBV.[2,3] Despite the development of these new drugs, treatment of chronic hepatitis B remains a clinical challenge, and the primary goal of current treatment remains relatively modest: to arrest disease progress and delay or prevent the onset of its potentially fatal sequelae.[1,4]
After uptake and intracellular activation, nucleoside and nucleotide analogues act as specific inhibitors of the viral polymerase and cause immediate termination of HBV DNA synthesis, which results in rapid and dramatic decreases in viral load. This impressive early response occurs in the majority of cases, but long-term response rates are poor, with frequencies of HBeAg seroconversion after 1 year of the order of 20% or less. Post-treatment relapse is common, even in individuals who undergo HBeAg seroconversion, and HBsAg seroconversion occurs rarely. Thus, overall long-term responses to nucleoside and nucleotide analogues are only slightly better than responses to interferon-alpha, the only drug previously approved for treatment of chronic hepatitis B in most countries. Interferon may still be the treatment of choice in some cases, despite disadvantages of limited efficacy, high cost, and frequent occurrence of dose-limiting adverse side effects.[1,4,5] Preliminary evidence from clinical trials indicates that use of pegylation can improve both pharmacologic properties and efficacy of interferons (see below).
Continuing long-term treatment with nucleoside and nucleotide analogues increases the risk of drug resistance, which occurs in vivo as a result of selection for viral mutants that encode altered polymerases.[5,6] Resistance develops at cumulative frequency of about 20% per year of treatment with lamivudine. Adefovir resistance occurs less frequently (about 2% annually) and, although data are preliminary, entecavir resistance may occur even less frequently. Drug-resistant HBV mutants have been found to replicate inefficiently in vitro and were initially considered less fit, but the emergence of drug-resistant HBV is often associated with hepatic flares and decreased clinical benefit in patients with compensated disease, and with more serious clinical consequences in patients with advanced liver disease; moreover, drug-resistant HBV remains potentially infectious.
As more antiviral drugs become available, resistance is becoming an increasing concern.[5] Clinicians can help to prevent the spread of drug resistance in 3 main ways:
avoiding unnecessary drug use,
careful choice of drugs and drug combinations, and
continuous surveillance for drug resistance.
Avoiding Unnecessary Drug Use: Prevention Is Better Than Cure
The most obvious way to reduce drug resistance is to avoid unnecessary drug use. Because of the unusual replication strategy used by HBV, viral populations are genetically heterogeneous, implying that even treatment-naive patients may harbor drug-resistant mutants that constitute only a minor component of the population in the absence of selection pressure from antiviral drugs.[5] A majority of patients may not require antiviral therapy. Several concerned organisations, (including AASLD, EASL, APASL, and the NIH) publish regularly updated guidelines to assist clinicians with recognition, diagnosis, prevention, and management of chronic hepatitis B: these are unanimous in recommending that therapy should be considered only for patients with more active or advanced liver disease and others most likely to respond.[4] Treatment algorithms have been developed to assist in identification of suitable candidates for treatment and to determine when to initiate treatment.[5,7]
Careful Choice of Drugs Can Minimize the Incidence of Resistance
Expansion of drug-resistant mutant populations is absolutely dependent on replication, so antiviral therapy, once initiated, should aim to suppress viral replication as potently and as rapidly as possible.[1,4,5] Currently, interferon, lamivudine, or adefovir dipivoxil can all be considered as first-line therapy for individuals with noncirrhotic liver disease, and entecavir will soon become an additional option. Mutations that confer resistance to lamivudine confer cross-resistance to other L-nucleosides and reduce sensitivity to entecavir but not to adefovir or tenofovir. Conversely, mutants that are resistant to adefovir and tenofovir remain sensitive to L-nucleosides and entecavir. Multiple mutations are required for high-level resistance to entecavir.[8] The lower risk of resistance to adefovir dipivoxil and entecavir supports their use in liver transplant patients and those with cirrhosis or decompensated liver disease, since development of drug resistance is more likely to precipitate clinical deterioration in these groups.[5]
In the future, combination chemotherapy will almost certainly be used increasingly to treat chronic hepatitis B. Provided that appropriate drug combinations are used, this approach gives well-recognized benefits, including reduction of the risk of drug resistance. This is because, while the preexistence or rapid evolution of viral mutants with the potential to resist individual drugs is almost guaranteed by high HBV loads and rapid turnover in vivo, the preexistence or evolution of multidrug-resistant mutants is much less likely. Ideally, drugs used in combination should have different mechanisms of action and act additively or synergistically.[9] Use of interferon in combination with nucleoside or nucleotide analogue therefore seems logical. Although early clinical trials of such combinations were disappointing, recent results from trials with pegylated interferon and lamivudine are more promising.[10-12] While combinations of L-nucleosides are unlikely to provide any benefit, the lack of cross-resistance between lamivudine and adefovir dipivoxil, as well as some clinical data, supports their use in combination.[13,14] Preliminary data also supports the use of entecavir in combination with some other nucleoside/nucleotide analogues, but definitive recommendations will require support from ongoing clinical and cost-benefit studies.
Be Prepared: Surveillance for Drug Resistance
Progress during treatment should be monitored carefully so that drug resistance, if it occurs, is detected early, before disease progression resumes as a consequence of viral breakthrough. Serum HBV DNA titer is the best available indicator of HBV replication. Reductions in serum HBV DNA always precede biochemical and histologic responses; conversely, rebounds in serum HBV DNA precede reversals of biochemical and histologic responses. A standardized ranking system is needed to facilitate comparisons of the effects of alternative treatment regimes, since ways in which treatment efficacy is currently measured vary widely. The following definitions have recently been proposed.[5] An antiviral effect is defined as a minimum reduction in serum HBV DNA ≥1 log10 IU/mL from the pretreatment baseline within the first 3 months. Failure to achieve this decrease constitutes primary treatment failure. A confirmed increase in serum HBV DNA of ≥1 log10 IU/mL from the nadir following initially effective treatment constitutes secondary treatment failure.
Assays for serum HBV DNA and ALT should be performed 3 and 6 months after starting therapy to check for efficacy and compliance, the latter being the most common cause of primary treatment failure. Further assays at 6-month intervals during the first 2 years of treatment are recommended for patients with mild liver disease. Three-month assessments are recommended after 2 years, when the probability of developing resistance increases. Consequences of resistance manifest more rapidly and are more life threatening to individuals with advanced disease, for whom 3-month assessments are recommended.[5]
Managing Drug-Resistant HBV Infection
To date, only lamivudine resistance has been extensively studied. There are arguments both for and against continuing lamivudine treatment of individuals with compensated liver disease and without evidence of cirrhosis.[5] Switching to adefovir dipivoxil with or without continued lamivudine are alternative options. Although switching to entecavir (at a daily dose of 1 mg rather than 0.5 mg recommended for treatment-naive patients) after lamivudine failure has been shown to be effective in clinical trials, this strategy may encourage development of resistance to entecavir.[8] Patients with severe disease should be given add-on combination therapy immediately on confirming the presence of drug-resistant virus, since stopping therapy or switching drugs are both regarded as too risky for this group.[5] The relative clinical benefits and cost-effectiveness of these and other alternatives are still being assessed.
Intensive research aimed at characterizing the behavior of different clinically important HBV mutants is underway in many laboratories worldwide. The results, in particular those delineating patterns of resistance and cross-resistance, will be crucial for the design of optimal therapeutic strategies and maximizing the benefit from new antivirals. Ideally, treatment for HBV infection should begin at diagnosis, but this is not yet feasible because of limitations of existing drugs. Ongoing clinical trials and concurrent improvements in diagnostic technology guarantee that treatment options and opinions on patient management will continue to evolve, emphasising the importance of staying up-to-date with this exciting, rapidly-developing field.
References
1. Perrillo RP. New data on hepatitis B treatment. Published online at: [url]http://clinicaloptions.com/hepatitis.[/url]
2. Bristol's Baraclude (entecavir) recommended for first-line Hep B treatment [url]http://www.fdaadvisorycommittee.com/FDC/AdvisoryCommittee/Committees/Antiviral+Drugs/031105_entecavir/031105_EntecavirR.htm[/url]
3. Shaw T, Locarnini S. Entecavir for the treatment of chronic hepatitis B. Expert Rev Anti Infect Ther. 2004;2:853-871.
4. Lok ASF. HBV treatment guidelines: questions and controversies. Published online at: [url]http://clinicaloptions.com/hepatitis.[/url]
5. Locarnini S, Hatzakis A, Heathcote J, et al. Management of antiviral resistance in patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther. 2004;9:679-693.
6. Tacke F, Manns MP, Trautwein C. Influence of mutations in the hepatitis B virus genome on virus replication and drug resistance: implications for novel antiviral strategies. Curr Med Chem. 2004;11:2667-2677.
7. Keeffe EB, Dieterich DT, Han SH, et al. A treatment algorithm for the management of chronic hepatitis B virus infection in the United States. Clin Gastroenterol Hepatol. 2004;2:87-106.
8. Tenney DJ, Levine SM, Rose RE, et al. Clinical emergence of entecavir-resistant hepatitis B virus requires additional substitutions in virus already resistant to lamivudine. Antimicrob Agents Chemother. 2004;48:3498-3507.
9. Shaw T, Locarnini S. Combination chemotherapy for hepatitis B virus: the path forward? Drugs. 2000;60:517-531.
10. Chan HL, Leung NW, Hui AY, et al. A randomized, controlled trial of combination therapy for chronic hepatitis B: comparing pegylated interferon-alpha2b and lamivudine with lamivudine alone. Ann Intern Med. 2005;142:240-250.
11. Janssen HL, van Zonneveld M, Senturk H, et al. Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HBeAg-positive chronic hepatitis B: a randomised trial. Lancet. 2005;365:123-129.
12. Jang MK, Chung YH, Choi MH, et al. Combination of alpha-interferon with lamivudine reduces viral breakthrough during long-term therapy. J Gastroenterol Hepatol. 2004;19:1363-1368.
13. Westland CE, Yang H, Delaney WE 4th, et al. Activity of adefovir dipivoxil against all patterns of lamivudine-resistant hepatitis B viruses in patients. J Viral Hepat. 2005;12:67-73.
14. Maynard M, Parvaz P, Durantel S, Chevallier M, Chevallier P, Lot M, Trepo C, Zoulim F. Sustained HBs seroconversion during lamivudine and adefovir dipivoxil combination therapy for lamivudine failure. J Hepatol. 2005;42:279-281. 看了大家的观点，受益匪浅，我想谈谈自己的感受，这里我以问题的形式提出，希望大家一起讨论：
在目前的乙肝抗病毒药物的使用中，发现核苷类似物包括3TC、ADV、LdT等在使用中都存在耐药和停药后的反跳？为什么会如此？我想答案至少有二：1.核苷类似物只起模拟作用，干预病毒的复制，抑制病毒而不能清除，2.肝细胞内的cccDNA不能被完全清除，一旦“撤兵”，“敌人”又死灰复燃，所以现在推荐用药时间的延长，原来3TC要用半年－1年，现在要用1.5－2年，患者用药后“就像服了鸦片”，基于这种情况，我对目前的抗病毒药物的态度并不乐观，感觉现在的抗病毒治疗，总是不能解决根本问题，是不是乙肝抗病度治疗没有希望了？？？ 拉米夫定变异一般发生在用药后的8月,对变异,我的临床体会是:
1.向患者提前讲明;
2.出现变异后,可继续应用拉米夫定。请大家看《病毒性肝炎论坛》上有病例。
3.建议患者换用阿德福韦。
最后建议长期应用拉米夫定，可减少停药后的复发。
我的理论知识较差，说的不对的地方，请大家谅解。 lihai1999 wrote:
我们少数几例重肝患者早期是都停用的，经过重肝治疗和血液净化会好起来约50％，后来因为专家共识认为不应该停药（这种共识后来被许多研究结果证明是没有依据的），
我在这方面的经验不多,对于发生变异后是否停药,自己临床总结的更是少,总体上我还是赞同不要停药的好,继续服用拉米夫定,正如我前两天发言所说的那样,但李主任上面所说的也是有临床依据的,Antivir Ther. 2004 Apr;9(2)上的一篇文章也采用对照的方法,对是否停药的问题进行对比研究,结论是出现YMDD变异后继续给予拉米夫定治疗没有益处 !看来我们有点晕了,只能依靠自己的临床实践经验 总结来指导用药了.
BACKGROUND: Mutations in the sequence of the conserved tyrosine-methionine-aspartate-aspartate (YMDD) locus of the HBV RNA-dependent DNA polymerase (rt M 204 I/V) may develop after 6-9 months of lamivudine therapy. The current practice of continuing lamivudine therapy has been associated with hepatitis flares or even hepatic decompensation. In addition, experiments have shown that the defective replication competency of rt M 204 I/V restores upon addition of lamivudine. AIM: To evaluate whether continuing lamivudine therapy after emergence of rt M 204 I/V is appropriate. PATIENTS AND METHODS: The clinical courses of 66 patients with continuing lamivudine therapy (continued group) and 68 patients who discontinued lamivudine therapy (discontinued group) were monitored monthly or more frequently if condition required. Hepatitis flare, jaundice, hepatic decompensation and hepatitis B e antigen (HBeAg) seroconversion in HBeAg-positive patients were documented as events. RESULTS: In a 12-month period, hepatitis flares and decompensations occurred in 67 and 11%, respectively, in patients who continued lamivudine therapy, as compared with 54 and 7%, respectively (P>0.05), in those who stopped therapy. HBeAg seroconversion rate was 19% in continued group and 35% in discontinued group (P=0.08). Serum HBV DNA increased in 48 (73%) of the continued group, and the median level increased from 46 pg/ml upon first detection of mutation to 330 pg/ml (P<0.001) at the end of 12 months continuing therapy. In contrast, serum HBV DNA level in the discontinued group increased in 22 (33%) patients but decreased in 39 patients, and median level decreased from 172 to 55 pg/ml at the end of 12 months after stopping lamivudine. CONCLUSION: These results suggest that there is no benefit to continued lamivudine therapy after emergence of rt M 204 I/V. 欧洲肝病会议在即，让我们一起学习去年亚太肝病会议的一篇相关文献吧。
乙肝和丙肝中的抗病毒药物耐药性问题探讨
乙肝和丙肝中的抗病毒药物耐药性问题探讨
摘要 有六个因素和对抗病毒药物耐药的突变株的出现有关：病毒复制的数量和程度、病毒的突变频率、抗病毒作用位点本身的变异性、药物所致的选择性压力、所复制的突变株整体的适应性和有效的复制空间。乙肝和丙肝病毒都有很长的自然感染史，有的甚至长达几十年。在这期间，经过自然选择这些病毒适应了它所感染的宿主。在抗病毒药物长期的治疗干预下，从原先就存在的菌种中选择出了逃避的变异株。更甚着，逃避的变异株作为优势株出现，代替了那些不适应环境改变的野毒株。就乙肝病毒来说，耐拉米夫定病毒株的出现和肝功能恶化、肝病加重息息相关。以干扰素为基础的治疗产生耐药的分子机制表明治疗失败似乎是多因素的，涉及宿主和病毒两个方面。耐药性在临床和公共健康上的重要性是不言而喻的，我们迫切需要更加先进的治疗手段和方法来阻止突变株继续被筛选出来。
关键词：乙型肝炎，丙型肝炎，抗病毒药物耐药性的化学疗法
乙型肝炎中抗病毒药物的耐药性
乙肝病毒是一个DNA病毒，它在RNA介导下完成自身基因组的复制。而通过RNA介导是一种不同寻常的方式，它可以在我们认为是准种感染的正常过程中产生遗传变异的异质群体。这些准种表现出潜在的强大的适应变化环境的能力并且赋予病毒逃避宿主免疫和抵抗一般的抗病毒治疗的方法。然而，由于乙肝病毒基因组很小同时通过重叠读框产生相关的遗传节约，限制了乙肝病毒的遗传突变和进化，这也是在未来研究中需要进一步探讨的地方。
乙肝病毒基因组结构和基因重叠区的顺序
乙肝病毒基因组是目前人类所知最小的DNA病毒，它由特定的双链3.2kbDNA所组成的四个开放读码区构成。最长的开放读码区编码病毒的多聚酶。表面抗原（或包膜）基因的开放读码区完全位于多聚酶基因组中不同的读码区内。而剩下的两个基因，C（核心）和X，也部分和多聚酶基因重叠。通过使用不同的起始密码子来进行转录可以产生更多的遗传节约：S基因编码三个共同终端的表面抗原蛋白（前－S1，前-S2和S），C基因同时编码e抗原和核心抗原，X基因可能也编码一个以上的产物。任何一个基因的变异都有影响其它基因产物的可能。比如，在多聚酶基因上涉及耐药性的一些变异已经表现出能影响S基因产物的免疫原性。相反的，它同时也暗示着免疫的选择也可以影响药物的敏感性。
乙肝病毒多聚酶的基因产物也表现出一些酶的功能，而这些功能对病毒的复制的必须的，同时它在核衣壳的组装和包装上也起着协调的作用。乙肝病毒多聚酶包括了四个不同的区域:1.末端蛋白，作为逆转录的启动子；2.空白区；3.逆转录酶/DNA多聚酶和4.核糖核酸酶H区域。空白区和前S2区病毒包膜部分相重叠，但对病毒的复制却不是必要的。通常，和所有其它的依赖RNA多聚酶的病毒一样，乙肝病毒的逆转录酶会出错，因为它缺少5◎校对的核酸外切酶。乙肝病毒多聚酶的这种低水平的复制精确度使得在受感染宿主体内的病毒包括了一些遗传上存在异质性的病毒变异的准种。
和耐药性相关的因素
在至少六个相互关联因素的作用下出现了耐抗病毒药物的突变株：病毒复制程度、病毒突变率、抗病毒作用靶位点的易变性（蛋白的可塑性）、药物导致的选择性压力、耐药突变株和野毒株相比它复制的适合性或能力，可利用的复制空间。
乙肝病毒准种，复制率和选择性压力
在那些有高病毒负荷如1011或1012病毒粒子的宿主，比如在乙肝病毒携带者中，每天病毒以大约50％的速率进行更新是常见的。假定以一个保守且稳定的突变率10－4或10－5来说，计算表明在体内的病毒准种包括了所有可能的单点突变株和相对应这一序列的两到三个点的突变株。耐药准种因此必然作为受感染人群中一种次要的组成部分存在，甚至在开始药物治疗前。若缺少了选择性压力，那么最快的复制准种预期将要占支配地位。但是，如果“复制空间”有限，比如当所有的肝细胞都受到感染，那么本质和选择的严格性将是决定耐药性是否发展的主要因素。从理论上考虑，预计当原先存在的准种可能对一种或两种抗病毒药物耐药并从高病毒载量和快速复制率得到确证，那么原先存在的准种对三种或者更多的抗病毒药物耐药是不大可能的。这就是我们所知的组合疗法，也是使用多种药物联合治疗像HAART（高活性抗逆转录病毒疗法）来治疗HIV感染的基础。联合治疗将被用来抑制乙肝病毒的感染是极有可能的。
病毒的微型染色体和复制空间
乙肝病毒复制的策略不仅确保了一个很高的突变率，而且使得转录和翻译病毒RNA可以持续进行，甚至在前基因组RNA逆转录和复制导致DNA转录完全被阻断的时候仍可进行。所有的乙肝病毒基因产物都被宿主细胞的RNA多聚酶2从双链开始转录，共价闭合环状DNA和宿主的组蛋白有关，并共同形成受感染细胞核内的微型染色体。容纳新病毒微型染色体的能力被定义为“复制空间”，它受到可获得受感染细胞数目和每个细胞能容纳的微型染色体数量的的限制。每个被感染的肝细胞包含大约25到50个病毒的微型染色体，大部分肝细胞都会被感染。新的共价闭合环状DNA的合成和新的微型染色体的产生仅发生在肝生长过程中产生的未被感染的细胞里或肝细胞替换或从受感染肝细胞中移除微型染色体。在一些例子中，病毒的微型染色体能够通过宿主非细胞自杀性的免疫反应来清除，但是，另一方面，他们也可以毁于调亡的受感染肝细胞。建立新的准种需要复制的空间，而只有在可获得一定空间的前提下次要的准种才能得到扩充。在慢性被感染的个体里，假设坏死性炎症的活动度最小，那么肝细胞更新和乙肝病毒微型染色体的更新是慢的，这样可以使产生和扩大新准种的几率最小。在慢性感染的肝内，复制空间的缺乏可以抑制或阻止耐药准种的出现。然而，由上升的血清谷丙转氨酶所反映出来的进行性肝损害及相关联的肝细胞再生，这样就在肝门区“产生”了复制的空间。这就可以解释为什么拉米夫定耐药，其中一个宿主的危险因子是上升的血清转氨酶水平。
耐药准种适度的复制
既然由突变产生的耐药性通常会减少复制的适合度，如果能够补偿复制缺陷的话，在抗病毒的化学治疗中，二次突变（缺少选择性压力）可能被共同选择。与艾滋病病毒相似的是，突变所致的耐药性常常改变复制的保真性。减少多聚酶的活性可以用来减少选择性压力，并且增加产生新的准种的机会，而新的准种通过进一步形成突变来相对来说更加适应环境。要区分突变（与耐药性直接相关）和二次补偿性突变，只有通过体外测定基因型和表现型以及研究他们之间的关系才能知道。从临床的观点出发，尽管病人接受着抗病毒药物的治疗，病毒血症的症状却没有丝毫的缓解甚至更严重，那么这个病人就是耐药性的表现型。
抗病毒药物耐药性
至今为止，拉米夫定和阿德福韦一直是美国食品和药物管理局（FDA）承认的治疗慢性乙肝感染的两种药物。
拉米夫定
拉米夫定的治疗措施是以每日剂量100 mg口服，许多病例证明此药物可以使病毒血症的病情程度大大下降，肝脏疾病呈好转迹象或痊愈。然而这些好转的迹象却极少能够维持下去，因为拉米夫定耐药性逐ピ銮浚?谥瘟乒?讨衅淠鸵┞拭磕暌?4%-32%的速度上升，更甚者，在用拉米夫定治疗的两年后，其耐药率已接近100% 。其他因素包括治疗前血浆高浓度的HBV DNA和ALT 以及病毒复制的不完全抑制，都增加了拉米夫定耐药性发展的风险。庆幸的是，对拉米夫定的耐药性并没有导致对阿地福韦的交叉耐药性。
导致拉米夫定耐药性的突变使得体外对拉米夫定的敏感性降低了至少20-100倍。特异性突变导致了HBV病毒的YMDD 催化位点序列的甲硫氨酸被缬氨酸，异亮氨酸，或丝氨酸所替代，这种突变足以导致病毒对拉米夫定耐药。根据非依赖基因型命名法，氨基嵝蛄械母谋浞直鹪趓tM204V, rtM204I 和rtM204S。在单独情况下，rtM204I替代可以检测到，但rtM204V, rtM204S替代却只在B序列或A 序列有其他改变时才可被发检测到。在rt序列发现许多其他的二级改变，这些改变发生在与rtM204V/I/S联合时。其中有一些改变可能是补偿性的。用不同的检测系统将拉米夫定耐药的HBV突变株筛选到几个其他的NRTIs，尤其是其他的L-核苷类似物 。
病毒耐药性机制在分子水平由空间阻隔所介导。
阿德福韦酯
阿德福韦酯是一种口服的，有效地前体药物，作用于非环状脱氧腺苷酸，类似于阿德福韦。
自从2002年被FDA认可以来，临床上用它来治疗乙肝的病例逐渐增多。多个中心进行大规模的三期临床试验，给病人每日剂量10 mg，一直服用48周，结果表明阿德福韦的疗效可与拉米夫定的疗效相比较。随着治疗的进行，病毒血症得到控制的病例有所增加。 治疗60周之后，没有证据表明耐药性在发展。然而，在治疗96周之后，从两位患者体内分离出HBV突变株有较低的耐药性。因此，乙肝病毒对阿德福韦的耐药性远不如对拉米夫定的耐药性来得那么频繁，并且不会导致敏感性大为降低的后果。替诺福韦在结构上与阿德福韦有相关性，作为一种抗HBV的药物，被用在同时受HIV-HBV感染的个体，和阿德福韦一样有广谱抗病毒活性。
病毒对阿德福韦的耐药性是由丝氨酸替代了236位的天冬酰胺酸所致。236位的天冬酰胺酸定位在HBV rt N236T的D 序列上，这一改变不会显著影响病毒对拉米夫定的敏感性。耐药性机制仍未完全明了，但很有可能涉及催化效率及特异性的改变，因为苏氨酸比丝氨酸分子小一些，但更有亲水性，导致其间接的催化位点的不稳定。
耐药性HBV的致病性
耐药性HIV包含二次突变，可以部分或全部代偿。另外，削弱的复制适合度已从接受HAART治疗的病人中分离出来。在HBV感染过程中相类似的补偿突变一直存在。Ogata 和他的同事们首次报道这种现象，他们是在受乙肝病毒C基因型感染并且接受拉米夫定治疗的患者体内发现的这种现象。他们观察到频频发生的rtL80V/I 和 rtL180M与M204V/I联合改变导致了病毒对拉米夫定耐药。双倍的以及三倍的改变与更高的病毒负荷、增加的拉米夫定耐药性以及疾病恶化有关。纵向研究表明突变是造成序列改变的原因，两者几乎同时发生在病毒突破发生前，自治疗补偿后，突变株被野生的C基因型所代替。额外突变的能力可以补偿耐拉米夫定突变株的复制缺陷，这一事实随后由体外转染试验得以证实。
类似的观察已有记载，肝移植患者发展为有生命威胁的乙肝病毒感染 。从这些患者血浆中分离出来的HBV有代偿性突变，这种突变增强了病毒在拉米夫定存在时的体外复制效率。当突变导致包膜蛋白的G145R 或 P120T 位点发生改变，这种增强会更为显著。这些结果暗示如果治疗终止，在感染了这些乙肝病毒准种的个体内，其病毒负荷有可能会降低。
突变消除或降低了HBeAg的表达，同时也影响了复制效率。HBeAg阴性的慢性乙肝病毒感染最常出现在地中海地区，这种感染通常是以比HBeAg阳性的乙肝病毒感染更低的血浆HBV DNA 水平为特征。Hadziyannis 和同事们共同对一组患者进行了研究，这组患者感染了D 基因型,这种基因型包含基本的核心启动子和核前终止密码子突变，这种突变导致了HBeAg阴性的表型。这些患者（rt M204I）拉米夫定耐药性的发展与相对较快的病毒血症的发展、频繁的生化突破严重的肝病突发以及疾病进程有关。Chen等所做的体外实验证明一种普通的前核心突变株（G1896A）可以代偿耐拉米夫定乙肝病毒准种的复制突变。随后，有报道进一步证明耐药性HBV突变株能够导致严重的甚至是致命的疾病。
最近的一种出版物公布了一个耐拉米夫定乙肝病毒在男性同性恋性伴侣之间传播的病例，这使得药物耐药性的问题成为一项关乎公众健康的重要议题。在这个病例中，尽管急性期的病毒血症不太严重，但是患者的潜伏期和临床表现表明此患者是典型的急性乙肝感染。同时感染HBV和HIV病毒的患者的高发病率表明耐拉米夫定的乙肝病毒容易与HIV病毒共同感染患者。由此说明经常检测耐药性以及支持主动免疫计划以使得全球范围内控制乙肝病毒感染的重要性。
临床上针对乙肝病毒耐药性的方法
随着耐药性的发展，临床上用拉米夫定治疗的大多数病例其治疗效果正在下降，但是许多感染了耐拉米夫定乙肝病毒的病人仍然有血清学转化（即由HBeAg 阳性转化为HBeAb阳性），并且肝脏组织学检查也证明了这一点。短期随访中发现对拉米夫定耐药病例的出现并非主要是负面效果，尤其是对于患有轻度疾病的免疫活性病人。然而，对于免疫受抑尤其是同时有艾滋病感染的病人，以及那些肝硬化免疫活性病人，肝功能代偿障碍的病例甚至还有死亡病例都曾被报道过。关于对拉米夫定耐药的HBV感染者的最佳治疗方案也有所不同。
下面是常用的几种选择：
（ⅰ）尽管有病毒学的突破，用拉米夫定单独治疗可以使血浆ALT水平保持在正常水平。然而这种方法却可以提高正在进行的乙肝病毒突变株的选择性。而这种选择也许会改变肝脏疾病的自然史。
（ⅱ）如果用拉米夫定的治疗停止，那么正在感染的HBV通常会回复到野生型。至今为止，至少有两项研究表示拉米夫定治疗停止时病人是安全的，即使这些病人有ALT增高和出现病毒血症的迹象。
（ⅲ）用第二种药物（如阿德福韦）治疗对拉米夫定耐药的乙肝病毒感染者是敏感有效的。这个分支也被称之为救援治疗。如果病人处在肝硬化阶段，这种治疗很可能是最安全的治疗方案。一项正在进行的研究表明在肝移植患者的治疗中，阿德福韦单独用药的疗效与阿德福韦与拉米夫定联合用药的疗效同样有效。
（ⅳ）用干扰素进行治疗。最近日本的一项研究表明在乙肝病人发展到LMV耐药且伴有血浆ALT转氨酶升高（）200IU/L）时用α-干扰素治疗，将会使30%左右的病人发生血清学的有利转化，但是α-干扰素在其中的作用还有待于进一步的研究。
抗丙肝病毒药物的耐药性
针对治疗慢性丙肝的新药（尤其是特异性丙肝抑制剂）的研发对丙肝病毒的耐药性几乎已经确定起了一定的作用。慢性丙肝是一种可以治愈的疾病，但是在接受当今α-干扰素和利巴韦林两种药物的治疗后仍有相当部分的病人并未治愈。
α-干扰素治疗和α-干扰素-利巴韦林联合治疗失败，似乎表明丙肝病毒的多因素耐药性很可能是失败的原因之一，正如治疗失败多发生在1型和4型基因型，而不是发生在2型和3型的事实所表明的一样。病毒的动力学研究表明2型和3型对于体内干扰素的直接抗病毒作用更为敏感，但是其机制尚未明了。
另外，在1型和4型感染者受感染的细胞似乎有更长的半衰期，这也许是由于丙型肝炎病毒复制以及与宿主进行免疫应答时复杂的交互作用所造成的，就如同病毒与肝细胞之间的关系一样。丙型肝炎病毒作为一种准种在受感染病人之间传播，可是其治疗失败却与内在的干扰素抵抗性HCV变种无关。
感染性准种在构成上的更有意义的改变是以最适应的变种为标志，这种最适应的变种是随着治疗进程以及随之而来的停药而被不断地选择出来的，这种选择存在的前提是与保持病毒生物功能的需要相关的病毒结构具有强烈的保守限制性。更多最近的研究集中在宿主的因素和α-干扰素对慢性丙型肝炎治疗失效的问题上，许多学者都提出了很多治疗性的策略，用这些策略来克服负性调节α-干扰素信号转导途径的可能的抑制作用。
病毒在进化过程中已发展了多条机制来应对α-干扰素的抗病毒疗效。干扰素由大多数细胞在对病毒感染的免疫应答中产生。α-干扰素与其受体的结合介导一条信号转导的级链反应，导致干扰素诱导的基因的转录。尽管这些基因中的大多数功能还未曾知晓，但是已有的数据显示其中一些基因具有抗病毒活性。例如，2'，5'腺苷酸合成酶（2,5 OAS）由双链RNA激活，合成2，5-多聚腺苷酸链，接着再激活RNaseL。潜在的RNAse会降解与多聚核糖体无关的病毒内的和细胞内的RNA。MxA是一种三磷酸-鸟嘌呤核苷，抑制许多RNA病毒的复制。α-干扰素和病毒抗原针对免疫系统的介导表达，使得主要的组织相容性复合物Ⅱ型抗原也被诱导或上调。研究得最彻底的α-干扰素诱导的抗病毒基因是双链RNA 激活的蛋白激酶PKR。PKR 具有许多细胞学功能，如前凋亡功能，生长控制，细胞分化，以及在对病毒感染的应答中主要是抑制转录。
对所有这些α-干扰素诱导的基因都进行检测，以便于发现他们在丙型肝炎病毒对α-干扰素耐药性中的角色，发现大多数基因都处在蛋白表达水平。在干扰素应答的过程中产生的蛋白质是一些酶。这些酶需要进一步的研究其活性，如2,5OAS pr PKR。因此，也许是酶的活性而不是蛋白表达，是分析α-干扰素对丙肝病毒的疗效或是丙肝病毒基因在α-干扰素应答中的效果的关键所在。
两种丙型肝炎蛋白NS5A和E2已被证明与病毒调节宿主对双链RNA的应答有关。这两种蛋白都能够结合并且抑制PKR。然而，一些分子流行病学研究认为E2和NS5A的PKR相互作用区域的序列与丙型肝炎病毒持续而广泛针对以干扰素为基础的治疗的耐药性有关。这些研究表明E2和NS5A也许通过抑制细胞内抗病毒应答来参与促成病毒的持久性，而这种细胞内抗病毒应答则是由双链RNA启动，由PKR途径转导。Enomoto 最先鉴定出NS5A的干扰素敏感性决定域（ISDR）并且表明：与HCV-1b原始型（野生型）相比较，在NS5A蛋白（突变型）的碳端密码子2209与2248之间至少有四个氨基酸发生了改变，这种改变与持续的对α-干扰素的病毒学应答直接相关。Taylor认为丙肝病毒的E2蛋白包含一个12个氨基酸序列，这个12个氨基酸序列类似于PKR自磷酸化位点和转录起始因子 e IF2a 磷酸化位点，而后者是PKR的靶标。这被称之为PKR-e-IF2a磷酸化同源结构域。这些调查人员表明是单独的1型基因型的PePHD而不是2型或3型PePHD抑制了PKR激酶活性，消除了它对蛋白合成以及细胞生长的抑制。总的来说，丙型肝炎病毒能够干涉α-干扰素诱导的信号转导途径，从而消除α-干扰素的下游抗病毒疗效。
结论
在经过了近30年的努力之后，既安全又有效的抗乙肝药物终于问世了。 随着这些药物的使用在临床越来越普遍，病人的依从性使得乙肝病毒对这些药物的耐药性将降低。乙肝病毒新的变种需要研发新的药物，疫苗以及制定治疗方案，预计对乙肝病毒新的变种的控制将会是人类在最终攻克乙肝病毒感染的道路上的又一个挑战。然而，控制慢性乙肝病毒感染的前景并非一片光明。新药的研发，对乙肝病毒生物学及发病机制的知识的发展，敏感性更高的诊断性实验的开展，以及不断更新的免疫接种计划都对控制慢性乙肝病毒感染起到了很好的作用。
尽管在慢性乙肝病毒感染中，乙肝病毒有产生一系列几乎无限的准种的能力，然而大多数准种的生存能力在一定程度上是有所削弱的，因为乙肝病毒基因组显著的紧密结构限制了这一点。从另一个方面说，单个基因的突变至少会影响到一个基因，并且导致病毒表型出现复杂的难以预料的后果。更好地认识由基因叠加带来的限制性以及更深入地理解基因型与表型之间的关系将会有利于找出最优化的抗病毒策略。
病毒的耐药性能否继续发展与选择性压力的严重性以及准种的多样性直接相关。突变的产生依赖于复制，所以充分有效的抑制病毒复制能够阻止病毒耐药性的发展。如果病毒复制被抑制足够长时间，病毒负荷一定会降低到某一点，在这一点上病毒持续产生准种以抵抗新的药物治疗的能力将大为下降。这一理念在临床上的应用即是要求对联合治疗方案进行优化，类似于针对HIV感染所采用的HAART治疗措施。乙肝病毒的彻底根治需要清除细胞核内的病毒微型染色体池，而这依赖于正常细胞的更新或者是宿主免疫功能的重新激活。
至于丙肝，随着收集的数据增多，有越来越多的证据表明，丙型肝炎病毒在多种机制中充分参与改变宿主细胞内环境，促成了持续的病毒复制。未来的抗丙肝药物的研发方向将是阻止这些病毒复制的过程，设计出相应的治疗策略，那样的话，丙型肝炎病毒的复制将会完全被抑制。 随着拉米夫定应用的日益广泛，深入探讨拉米夫定相关性HBV变异的机制，探讨和评价拉米夫定相关性HBV变异的临床意义，对临床工作指导意义很大。尽管共识不断更新，但争论从来就没有停止过。感谢飞越2004站友主持本期专题讨论，受益匪浅！
作为临床医生，我简单地谈谈自己应用过程中的体会，经验有限，欢迎大家批评指正。
1.YMDD变异的机理
诱变学说和优势选择学说各有道理，本人倾向于接受优势选择学说。
2.YMDD变异与拉米夫定耐药
YMDD变异出现不代表着拉米夫定耐药，拉米夫定耐药也不意味临床的恶化。少数病人的确会因YMDD变异致严重肝炎或肝功能失代偿，甚至死亡，不容忽视。
3.YMDD 变异后的对策
（1）对于无失代偿性肝病基础病人：继续应用拉米夫定或者停用拉米夫定都相对安全。部分病人继续用药可以提高血清转换率，甚至HBVDNA会自发阴转，肝脏组织学改善，对于这些病人来讲，过早地停药显然是不合适的。同样，继续应用拉米夫定提高正在进行的乙肝病毒突变株的选择性，从而导致病情加重，此类病人理论上应停用拉米夫定，停药后野生株再度成为优势株,病情会短暂好转。但是好转之后往往继而出现病情的反复及恶化，对此类病人来讲，再次应用拉米夫定仍然会有效，但我们的观察，再次用药后一段时间后会仍然会出现YMDD变异，而且出现的时间往往较第1次YMDD变异更为迅速，幸运的是，此类病人出现失代偿的几率相对较少，及时换用ADV还是比较安全。
（2）对于有失代偿性肝病基础病人：继续使用拉米夫定或者停用拉米夫定都不安全，临床上往往会有“骑虎难下”的感觉。尽管2004年的共识中提出“原则上应继续使用拉米夫定”，事实上，正如lihai1999主任所言，该原则被许多研究结果证明是没有依据的。目前唯一有效的办法是更换阿德福韦。很多专家都建议加用ADV后3月左右可以停用拉米夫定，但个人以为此时的联合并无必要，单用阿德福韦的效果并不差，联合也不见得比单独应用效果强。
（3）关于α-干扰素在拉米夫定相关性HBV变异的应用：g2008站友提出联合干扰素治疗取得了很好的效果。个人应用的体会是初始治疗时，二者联合应用会有限地提高血清转换率，降低了用药过程中的YMDD变异率，但效果也不是很理想。如果初始治疗选择单独应用拉米夫定，出现YMDD变异后，再联合应用α-干扰素，做为没有ADV时的一种备选方案未尝不可，但疗效有限。
4. 拉米夫定真的就是昙花一现吗？
骆抗先教授曾说过：拉米夫定的问世，打破了α-干扰素做为唯一抗HBV治疗药物的局面，是乙型肝炎临床治疗学在一起重要事件。拉米夫定治疗有效的患者，明显改善了预后，延缓或阻止了肝硬化、肝癌的发生，从这一点上说，我们不能否认拉米夫定的功绩。但拉米夫定也具有明显的不足，比如血清转换率低，疗程长，停药后复发，以及人们担心日益加重的YMDD变异等。拉米夫定真的就是昙花一现吗？这不仅仅是飞越2004 站友的质疑，也是我们共同的关注。就目前的现状而言，把希望仅仅寄托在拉米夫定上显然不可，但放弃拉米夫定同样不妥。即便是有新的抗HBV药物不断问世，但拉米夫定在疗效、价格等方面的优势仍不容忽略。做为医生，应深刻认识慢性乙型肝炎抗病毒治疗的必要性、艰巨性、长期性。目前的抗HBV治疗，远不能达到一蹴而就。我们能够做的，就是在病情的把握和药物的选择上发挥医生的作用，最大限度地发挥拉米夫定的作用，避免拉米夫定不合理的应用。
对于拉米夫定相关性HBV变异，我们仍然有很多困惑，而这，也正是医学的魅力和我们努力的方向所在。 感谢大家参与本期由本人主持的专题讨论,由于众所周知的原因,未能就该主题的讨论开展的更好,以致于参与的人数颇少,深感愧疚,同时也真诚的感谢各位版主和参与讨论以及感染版的各位战友..
正如开篇所言,希望通过本专题的讨论,以期待达到更加规范的应用拉米夫定,同时也有利于指导未来可能的各种核苷类抑制剂临床应用,若能对大家有一点益处,本人方感觉一点安慰.
因为各种原因,乙肝的治疗目前为止仍然是一个大问题.干扰素在乙肝治疗中的地位这么多年来无用质疑. 干扰素( IFN) 抗病毒治疗慢性乙型肝炎已有20 多年历史,对具有适应证的患者约30 %可获长期持续效应,但其也有自身不可克服的缺点,如适应对象相对较窄、疗效远非理想(特别是经垂直传播感染者疗效差) 、使用不便以及药物不良反应多等。然而以拉米夫定为代表的核苷类抑制剂的出现使得我们开始重新评价干扰素的地位问题, 拉米夫定是在我国和全球被批准的第一个治疗慢性乙型肝炎的口服药。1996 年该药在我国启动Ⅰ至Ⅲ期临床试验;1998 年12 月被我国国家药品监督管理局批准为一类新药;1999 年投放市场;2001 年实现国产化。至今已有数十万乙型肝炎病毒感染的现症患者接受该药治疗而得益,不但极大地丰富和深化了临床实践,也取得了宝贵的经验教训.我们对于拉米夫定曾经充满希望,然而经过了短短的7年的拉米夫定治疗乙肝的临床应用,我们现在却不得不坐下来冷静的思考拉米夫定治疗过程中的相关问题,以利于我们在攻克乙肝的道路上走的更好.
拉米夫定只能抑制增殖状态病毒核酸的逆转录酶,而对肝细胞内非增殖状态的病毒DNA(cccDNA) 则无效,停药后可致DNA 再增殖,激发肝功能损害,这种情况有人称为停药后复燃(post treatmeant flare) 。另一种情况多是出现在给药6～9 个月后或更长时间,在用药过程中HBV DNA 再增殖,称为反弹(break through) ,这是因为出现了对拉米夫定耐药的YMDD 变异株。这两种情况常常是当前临床医师困惑的问题。本期专题讨论就是针对后一问题进行相关讨论.
众所周知,遗传和变异是生物界普遍现象,从某种意议上说,生物进化就是变异的积累,生物性状通过遗传使其种属得以保存,在传代过程中通过变异使适者生存。在细菌,其耐药机制有突变和质粒介导两种。前者是细菌DNA 发生变异的结果;后者是将耐药菌种发生变异的DNA 通过转化、转导(如噬菌体) 、结合和易位等方式传递给敏感染菌。病毒结构简单和增殖速度较快更易变异。这种变异可自发或诱导,无论病毒或细菌,均会对外界压力干预产生反抗,表现为变异,结果是耐药生存。因此,拉米夫定应用过程中HBV 出现变异株完全是符合客观规律的。
相关检测表明拉米夫定相关变异绝大多数发生在YMDD区.然而最近有究研究表明,在15 %～25 %未曾用过拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者的血液中存在YMDD 变异株,因此,实际上YMDD 变异出现并非应用拉米夫定所特有.目前通常将拉米夫定应用过程中出现的YMDD变异分为两型.也有报道YSDD变异的纯在.普遍的认为YMDD变异的出现与耐药直接相关,但目前还有更多的研究在进行中.可能提到最多的是,YMMDD变异同时伴有某些位点的代偿性变异是导致YMDD 变异后出现病情加重的重要因素.拉米夫定相关变异后的处理可以参见2004年拉米夫定治疗共识.总体而言YMDD变异生物学意义并没有完全清楚,这需要我们更好的进行研究.我们就本专题的讨论才开始,而且可能仅涉及到一些皮毛问题.
从科学发展观来看,新生事物总是在发展过程中逐步完善的,通常也不会一帆风顺。如1940 年分离提纯青霉素,发现其后在感染小鼠和人体均有明显抗感染治疗作用,由此开创抗生素化疗的新纪元,金黄色葡萄球菌所致的最普通而严重的感染一度被控制。但上世纪50 年代出现产青霉素酶的耐药菌株,其感染病死率又复上升,再次成为了细菌感染的主要问题。以后随耐青霉素酶的半合成青霉素和头孢菌素相继问世,使耐药问题得到很大解决。正由于青霉素的发现和他的耐药性、不良反应和局限性,使半个多世纪以来抗生素得到日新月异的发展,而其本身仍没有被淘汰。拉米夫定的情况与青霉素有类似之处,上市7年虽然其耐药性成为继续推广应用的一个问题,但这个问题正在不断地得到克服和解决。可能更加有利于拉米夫定在临床中的应用,同时也为未来核苷类抑制剂的应用提供了很好的帮助.
阿德福韦即将在临床上市了,它的价格并不太贵.就其商品名代丁而言,商家的期待是可以理解的,但作为临床医师而言,我们对任何药物的应用均应严格掌握其适应症,同时应了解治疗过程中可能出现的有关问题.在美国恩替卡韦也已经被批准应用于乙肝的治疗.我想以拉米夫定为代表的核苷类抑制剂的出现必将导致更多的相关药物的出现,而事实上也的确开始成为现实.各种核苷类抑制剂的出现必将更加丰富乙肝的治疗选择,欣喜之余我们应该清楚,攻克乙肝的道路还很远很远,所以我们应仔细研究乙肝治疗过程中的各种问题.
一些废话,再次感谢各位版主和战友. 各们战友谈了很多。很详细，很好！这里我谈一点个人临床体会。
拉米夫定特点：
1、核苷类似物，竞争性抑制剂。竞争性抑制剂特点就是两种类似的底物结合同一个受体，谁的浓度高就表现为谁的作用，因此从理论上来看，拉米夫定的反跳几乎是必然的，也曾经在外出开会的时候提出过这个问题，就是停药（LAM）不反跳的机制是什么？回答也是不十分肯定，就笼统的答应该有免疫系统的参与。
2、有效期间肝功往往十分稳定。但停药后肝功极易反复，从个人临床观察，往往是停药后4-6个月后容易出现反复，许多同类的文章也有类似感想。个人理解：停药后病毒复制反跳，野毒株重新占优势的时间与这段时间吻合，而且病毒学检测也符合，因此，可能长期的抑制状态使机体免疫耐受程度降低后，高复制状态的野毒株容易诱发机体产生免疫清除，可能一段时间才能重新达到平衡，在这之前肝功极易反复。我手上好多病人甚至反复超过半年以上。
3、变异后病情加重（未停药）问题：许多的临床验证都认为大部分YMDD出现变异者，病毒的毒力比野毒株轻，但也有报道，当P区出现B/C两段同时变异时，其毒力有可能不比野毒株差，不过比例不高。但目前的检测方法主要是单测YMDD的为多，这类情况很难从实验室中获得信息。但整体上看，拉米夫定变异后出现肝功损害急剧加重者往往都是停药后发生，尤其是擅自停药的。出去开会跟其他人交流过，大家也都探索一些可以使停药后平稳过渡的方法，比如拉米夫定减量（1/2片QD）（在做药理时发现，1/2片QD有90%的效果），但这种方法不是说明书上的方法，大家若想尝试时应谨慎。还有换用其它抗病毒药（IFN，甚至其它效果很差的抗病毒药：苦参碱，百赛诺，老的抗病毒药，可耐等）过渡（等肝功损害时，也有人停药后待肝功异常出现时再用），然后再停药。至少从我们近些年来严重肝损的发生极少了。
停LAM出现重肝后感觉上比过去碰到的重肝难治，个人经验中感觉用可耐（磷甲酸钠）抑制病毒可以获得一些效果，虽然可耐副作用很多，但临床上用起来还是很顺手，很少严重不良事件，黄疸高不是禁忌症。其它的差别不大。不过这类病人一旦控制不住很可怕，一天一个样。再怎么做人工肝都没什么用，个人认为还是与免疫耐受程度降低有关。因此停药后应密切观察，发现苗头，及时制止。
4、停药后其它核苷类似物替代问题：目前上市只有ADV。其它还在做临床研究还有像恩替卡韦，LDT等。但这类药物没有脱离竞争性抑制剂的范围，因此拉米夫定碰到的问题，这药些药都没有从根本上解决，只是一个阶段性替代，有人提这样的想法，就是轮换制，但没有经过临床检验，优劣有待进一步临床评估。而且现有资料来看，ADV对病毒的抑制不如LAM。
5、疗程问题：这可能是最没有答案的问题，现在很多的专家都在回避这个问题，而且观察终点的设定都是在没停药时，这样的临床验证太缺乏说服力，尽挑好的说，谁不会！？个人认为变异后如果病毒载量不是很高，继续服药，如果病毒载量高，或发生P区B/C段同时变异（如果能测的话）建议停药或考虑换药。
6、正确评价LAM的作用：
LAM是个优缺点都十分突出的药物。
它在有效期间能获得多少组织学的的受益目前还是没有大样本的观察（主要是观察终点我认为许多验证都放在未停药时，虽然更长时间的验证很难，但我个人认为还是坚持应该放在停药后1-2年左右，这样的观察才有说服力），另个一方面病人接受肝穿（尤其抗病毒后的肝穿）还是有些困难。但从理论上来讲，长时间肝功的稳定应该有助于组织学的改善。其它的药物目前很难达到说有效期间肝功极稳定的。
LAM所有的问题几乎都与变异有关，变异后的停药，变异后的肝功加重/反复/甚至出现重肝。但目前还是有一些手段可以处理。因此不能因为这个问题做为回避的理由。当然用之前最好把这些问题都跟病人讲清楚，这样病人的依从性就会好得多。
以上主要是临床体会，缺乏很好的循证医学基础，欢迎大家批评指正。
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