抗HBV新药
雪花六出，新年伊始。先祝大家新春快乐！本月讨论的题目是抗HBV新药，我们将就以下题目进行讨论：1、 抗病毒新药对乙肝病毒的作用靶点
2、 抗病毒新药的种类和特点
3、 已经发现的耐药性病毒变异发生和对策
4、 临床使用这些新的药物的心得体会
为了讨论面更宽广一点，将目前尚有争议的胸腺肽类药物纳入到本次讨论范围，因此讨论药物包括4大类，1、干扰素类，使用最早，最有经验的药物，但目前仍然不断有新品种推出，如长效干扰素等，2、核苷类似物，目前最流行，已经有两个品种通过FDA，仍然不断有很多品种在做2/3期临床试验。3、胸腺肽类药物，尽管有争议，结果十分不一致，也请大家谈谈体会。4、其它手段：RNAi，反译寡核苷酸，治疗性疫苗，细胞因子，小分子特异HBV抑制剂等。
欢迎大家发表看法和意见！
转自dxy
阿德福韦酯是最新FDA批准用于乙肝临床新药，简介如下：
一、作用机制
阿德福韦酯是腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韦的前药，其分子式为C20H32N5O8P，分子量为501.48。口服后，在体内转化为阿德福韦发挥抗病毒作用。阿德福韦是单磷酸腺苷的核苷酸类似物，在体内通过细胞激酶作用被磷酸化为具有活性作用的二磷酸阿德福韦，二磷酸阿德福韦抑制HBV DNA多聚酶或逆转录酶作用机制包括：(1)竞争脱氧腺苷三磷酸底物；(2)终止病毒DNA链延长。二磷酸阿德福韦对HBV DNA多聚酶的抑制常数为0.1mmol/L；对人类DNA多聚酶α和γ的抑制作用较弱，其抑制常数分别为1.18mmol/L和0.97mmol/L，因此，治疗剂量对正常细胞没有毒性。
二、药效和毒理
在体外实验中，阿德福韦抑制HBV转染人肝细胞瘤细胞株HepG2和HB611细胞病毒复制的半数抑制浓度（IC50）分别为0.2～2.5mmol/L和0.2～1.2mmol/L。二磷酸阿德福韦在细胞内的T1/2为30h，故作用较持久，可以每天给药一次。
拉米夫定耐药株涉及HBV DNA聚合酶M552V、M552I、L528M、L552M/M552V位点的突变。在体外实验中发现这些突变体对阿德福韦仍敏感，与野生株比较，它们的抑制常数增加了不到2.2倍，而拉米夫定对变异株的抑制常数则增加了8～25倍。这些资料表明，阿德福韦可以治疗对拉米夫定耐药的HBV，而且与拉米夫定联合治疗可以有效控制对拉米夫定的耐药。同时，体外实验也发现阿德福韦对泛昔洛韦耐药株也较敏感。
在体内实验中，发现阿德福韦能有效地抑制鸭乙型肝炎病毒和土拨鼠肝炎病毒（WHV）的复制。给予慢性感染WHV的成年土拨鼠每日口服5mg/kg、15mg/kg的阿德福韦或安慰剂治疗12周，治疗后5mg/kg剂量组WHV DNA水平减少了260倍，而15mg/kg剂量组则下降了1000倍以上。
三、耐药和病毒变异
阿德福韦较少产生耐药的分子学基础包括：(1)阿德福韦与自然底物dATP在结构上非常相像；(2)阿德福韦具有灵活的开链连接；(3)具有磷酸键。
629例患者在治疗48周后接受了病毒变异的检测，结果未发现产生阿德福韦耐药的病毒变异。2003年美国肝病年会上，Gilead公司报道，238例患者在治疗96周时有4例发现N236T位点的变异，发生率为1.7%，并证实N236T变异与阿德福韦耐药有关。另一可能与阿德福韦耐药有关的A181V位点突变，96周时的发生率为0.8%。
另外一项研究是早期进行的针对HBeAg阳性、ALT异常或正常的二项双盲、安慰剂对照研究的延续。患者在治疗中没有出现血清转化，也没有出现与治疗相关的毒性反应，患者自愿继续接受治疗。剂量开始为30mg/d，后改为10mg/d。在长达136周的观察中，阿德福韦对野生株和前C区变异的慢性乙型肝炎具有持续的抗病毒作用，而且没有发现与阿德福韦耐药相关的病毒变异。
四、临床研究
早期进行的针对HBeAg阳性、ALT异常或正常的二项双盲、安慰剂对照的Ⅱ期临床试验，疗程为12周，并随访24周。ALT异常临床研究的患者，接受剂量为5mg/d、30mg/d和60mg/d。治疗12周后，5mg剂量组血清HBV DNA较基线下降1 Log10，30mg和60mg剂量组血清HBV DNA下降3～4 Log10，而安慰剂组无显著变化；36周后，30mg和60mg剂量组HBeAg转阴率为27%，HBeAg血清转化率为20%，血清转化率增高与基线时ALT水平呈正相关。ALT正常的临床研究患者，接受剂量为30mg/d。治疗12周后，30mg剂量组血清HBV DNA较基线下降3Log10，而安慰剂组无显著变化。所有接受治疗的患者在治疗12周后进行基因检测，没有发现与阿德福韦耐药有关的变异产生。在这二项研究中，30mg和60mg剂量组均出现部分患者的肾功能损害，表现为尿素氮和肌酐的升高，出现肾功能损害的比例与剂量呈正相关，故在以后的延续试验中以10mg剂量组而代替60mg剂量组。
在一项随机、双盲、安慰剂对照的临床试验中，共有515例HBeAg阳性的患者进入研究。在前48周，患者被随机分入阿德福韦30mg组（173例）、阿德福韦10mg组（172例）或安慰剂组（170例）。48周后，30mg组接受安慰剂治疗至96周，安慰剂组接受阿德福韦10mg治疗至96周，10mg组则再次随机按1:1接受安慰剂或继续阿德福韦10mg治疗至96周。所有患者在第一次随机前6月内接受第一次肝活检，在治疗48周、96周后接受第二、三次肝活检。所有患者治疗96周后随访24周。治疗48周后，10mg组和30mg组组织学改善率（组织学改善定义为Knodell坏死炎症计分下降32分，且Knodell肝纤维化计分无恶化）分别为53%和59%，显著高于安慰剂组25%；10mg组和30mg组治疗后血清HBV DNA较基线时下降3.52 Log10和4.76 Log10，安慰剂组为0.55 Log10；10mg组HBeAg阴转率为24%，HBeAg血清转化率为12%，显著高于安慰剂组的6%和11%；10mg组ALT复常率为48%，安慰剂组则为16%。研究中，发现基线ALT水平与肝组织学改善和HBeAg血清转化呈正相关。
另一项随机、双盲、安慰剂对照的临床试验，共有185例考虑有前C区变异的HBeAg阴性的患者按2:1比例进入阿德福韦10mg组或安慰剂组。治疗48周后，10mg组组织学改善率为64%，显著高于安慰剂组33%；10mg组治疗后血清HBV DNA较基线时下降3.91 Log10，51%患者HBV DNA转阴，安慰剂组HBV DNA较基线时下降1.35 Log10，没有患者HBV DNA转阴；10mg组ALT复常率为72%，著高于安慰剂组29%。目前本项研究仍在进行中。
我国食物药品监督管理局于2000年12月批准该药在中国进行Ⅰ期临床试验。2001年6月～9月进行Ⅰ期临床试验，Ⅰ期临床试验包括3个研究方案：(1)在健康中国男性志愿者中，对单次口服阿德福韦片剂的安全性和耐受性进行评估的一项Ⅰ期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照的研究；(2)在健康中国男性志愿者中，对阿德福韦片剂的药代动力学进行评估的一项Ⅰ期、单中心、开放、拉丁方设计的研究；(3)在健康中国志愿者中，就连续6d，1次/d，口服阿德福韦片剂的安全性、耐受性和药代动力学进行评估的一项Ⅰ期、单中心、随机、双盲、安慰剂对照的研究。I期研究结果显示在健康中国志愿者中口服阿德福韦片剂的安全性、耐受性良好；10mg剂量下，未观察到肾功能损害；药代动力学参数与国外研究结果相似。2002年10月国家药品监督管理局批准该药在中国进行Ⅱ期临床试验。Ⅱ期临床试验在中国的总病例数为480例，均为HBeAg阳性、HBV DNA阳性、ALT增高的患者。全国有12个中心参与。目前，Ⅱ期临床试验已在2002年12月正式启动，2003年2月底已完成最后一例患者入组。
阿德福韦的肾脏毒性虽然在10mg/d剂量下发生率较低，但长期应用后是否会增加也是一个令人关注的问题，应密切观察肾功能的变化。另外，更长期应用后的病毒变异和耐药问题也须进行严密的观察和检测。与干扰素或其他核苷类药物联合治疗的前景、在特殊人群（老年人、儿童、孕妇、哺乳期妇女）中的安全性和疗效、是否能阻止母婴垂直传播等问题也需在不断的临床研究和实践中得到证实。 一些正在研究中化学药物：
Ldt：与乙型肝炎其它已批准或正在研究的药物不同，telbivudine是天然胸腺嘧啶脱氧核苷镜像形式未修饰的L-核苷，只能是乙型肝炎的聚合物才能识别LdT，人类细胞的聚合物则不能，这可以防止它抑制人类正常细胞的复制。在一个随机、多中心、跨国试验中，104名HBeAg阳性、未治疗过的成年慢性乙肝病人被随机分为或用拉米夫定的标准治疗(100 mg/day)，或LdT 400 mg/天、LdT 600 mg/天、LdT 400 mg/天加LAM、LdT 600 mg/天加LAM。开始时，所有病人的ALT比正常上限高1.3倍。第52周，全自动PCR检测仪（COBAS Amplicor）分析表明，血清HBV DNA的复制减少，标准LAM治疗是4.66 log10 copies/mL，LdT 400 mg/天是6.43，LdT 600 mg/天是6.09，LAM-LdT 400 mg是6.40，LAM-LdT 600 mg是6.05（单LdT ﹕单LAM的P < .05）。单LAM组的剩余HBV负荷量最高，平均HBV DNA水平为2.9 log10 copies/mL，而单LdT的平均HBV DNA已检测不到。单LdT组61%、LdT加LAM组49%、单LAM组32%的病人病毒水平检测不到（单LdT﹕单LAM的P < .05）。对含有LdT的联合治疗组，亚裔病人的平均HBV DNA减少6.3 log10 copies/mL，非亚裔病人减少6.0 log10 copies/mL。单LdT治疗的病人86%ALT水平正常化，单LAM有63% (P < .05)。与以前的研究结果一样，到第52周时HbeAg转阴的病人与还是阳性的病人相比，治疗前的平均ALT水平较高(212﹕168 IU/mL)，而平均HBV DNA 较低（8.7﹕9.4 log10 copies/mL）。LdT的抗病毒效果显著大于LAM，单用前者时ALT的正常化最高。联合治疗并不比单用此药更好。所有治疗组均很好耐受，没有明显的与治疗有关的副反应或实验室异常。
恩替卡韦是一种2 '-戊环脱氧尿嘌呤核苷类似物，具有极强的选择性抑制HBV多聚酶的能力。每日0.1～0.5mg的剂量即能有效抑制病毒复制；它也对YMDD变异引起的拉米夫定耐药有效。为了比较恩替卡韦剂量对药效的影响，Tassopoulos进行了一项大样本随机化的研究，实验对象共分4组，前三组分别予以恩替卡韦0.1，0.5，1.0mg/天，第四组每天予以拉米夫定100mg，所有的病人对所予剂量均能良好耐受，24周之后，予恩替卡韦0.5和1.0mg的病人中有50%～755%血清中的HBV DNA已无法用bDNA法测出，而恩替卡韦剂量为0.1mg组和拉米夫定治疗组都只有15%达到上述标准(p<0.01)；恩替卡韦剂量1.0mg/天的试验组有17%的病人用PCR法测得HBV DNA被完全清除，而剂量为0.5mg的患者中清除率为9%，拉米夫定组则仅有2%；0.5mg恩替卡韦组有近60%生化指标达正常，1.0mg和0.1mg组均为40%，而拉米夫定组只有20%。
Emtricitabine(依曲西他平)：以200mg/day治疗48周的受试者，61%达到血清HBV DNA检测不出的水平，50%HBeAg消失，23%获得e抗原－e抗体血清转换。其耐药变异的发生率(治疗1年)大约为6%。但其治疗慢性乙肝的作用有可能因与拉米夫定有交叉耐药而受到限制。
Elvucitabine：有可能成为最佳的抗HBV核苷酸类似物抑制剂。该药兼具抗HBV和HIV双重活性，在体外试验中显示该药活性较其它同类药物强10倍以上，并且血清药物浓度可达到超过拉米夫定耐药病毒的IC50水平。
Clevudine：是一HBV DNA聚合酶抑制剂，对鸭及美洲旱獭乙肝模型有抗病毒活性，其对病毒的抑制作用可持续到停药后6个月。以100mg/天，治疗至42周时，HBV DNA载量下降3.4log10，且未发现耐药变异。27%的受试者HBeAg消失，18%出现e抗原－e抗体血清转换。
LB80380/ANA380：一种膦酸酯类药物前体，核苷类似物，鸟嘌呤核苷单磷酸盐，有很强的抗HBV活性。该药物设计用来战胜目前已批准的药物存在的问题，比如拉米夫定的耐药性，阿地福为的肾毒性。LB80380/ANA380是种口服药物，由LB80331/ LB80317转换而来。LB80331/ LB80317都是新型的鸟嘌呤核苷单磷酸盐类型的核苷类似物，在实验室中表现出抗HBV活性，包括拉米耐药株。该化合物在实验室没有毒性特征，包括低的潜在的肾毒性。动物毒型研究证实LB80380/ANA380很安全，旱獭研究表明，用药4周，血清病毒滴度减少超过6个数量级。1期临床研究，健康志愿者显示好的安全性，耐受性，药物代谢动力学支持每天1次服药。我们报告1/2期临床最终研究结果，用来评估LB80380/ANA380安全性，药物代谢动力学，对HbeAg阳性，HBV DNA阳性患者的抗病毒活性。临床前实验室中的数据表明对野生株，YMDD变异株、阿德福韦变异株均有效 目前进入临床研究免疫调节药物
Pegylated interferon(聚乙二醇干扰素)：低滴度e抗原及低水平HBV DNA的患者对聚乙二醇干扰素反应较好，可作为疗效预测性因素。聚乙二醇干扰素对传统治疗困难病人的治疗较标准干扰素有更为持久的疗效，譬如ALT基线水平低者、治疗前高HBV DNA水平者以及肝硬化或肝纤维化患者。
α胸腺素：大量研究表明胸腺素对部分HBV感染患者有效，可使ALT复常、抗－HBe血清转换以及血清HBV DNA减少。然而，文献报道此药极具不确定性，有些研究结果示该药无何益处。因此，胸腺素的疗效尚需大规模的临床试验来进一步证实。
白介素－12：该药在动物模型显示具有抗病毒作用，并且在最近进行的一早期临床试验中观测到，该药可使部分入选患者血清HBV DNA在治疗初期即有明显降低。
树突状细胞疫苗：利用HBV特异蛋白在体外预先制备的DC而制成的自体疫苗可望成为未来的治疗办法。虽然DC疫苗的研究刚起步，但是，这种治疗方法在理论上可克服免疫耐受，并可激发多重特异性抗－HBV免疫应答。当然，还需要进一步研究、评价。 RNAi
在美丽隐杆线虫中发现RNA干扰现象之后，很快发现在许多类型的病原微生物中都存在同样的RNA干扰现象. 如果蝇、锥虫、涡虫、线虫，以及高等的哺乳动物细胞，甚至是人的细胞中也都发现类似的RNA干扰现象. 对其作用机制进行研究，发现是一些22-25 nt大小dsRNA产生抑制或降解靶RNA分子的作用，统称为小干扰RNA(small interference RNA， siRNA)，根据其发挥RNA干扰现象的dsRNA的具体长度又可以分成2类: 24-25 nt的长siRNA和21-23 nt的短siRNA. 这两种类型的siRNA都可以通过与靶mRNA分子进行序列特异性的结合、抑制与降解，阻断或破坏靶基因的表达. 另外一种可能作用的机制就是dsRNA诱导同源基因的甲基化，从而使目的基因表达关闭. 另外，小分子的dsRNA同时也是很强的干扰素诱导酶如PKR、RNase L的激活剂，可以产生类似干扰素的抗病毒效应.
RNA干扰策略在抗肝炎病毒治疗中首先在HCV的研究中获得了成功. McCaffrey et al设计合成了针对HCV NS5B基因区的dsRNA，当与NS5B表达载体进行共转染时，在鼠肝细胞中观察到dsRNA对于NS5B基因的表达水平抑制率达到75 %，如果dsRNA与NS5B的表达载体进行共转染，抑制率可以达到98 %. 说明siRNA策略在抗HCV基因治疗中的应用前景. 多年来由于缺乏合适的HCV感染/转染细胞模型，因此对于抑制HCV的研究进展缓慢. 近年来关于HCV复制子(replicon)的建立，使得在细胞系水平上研究siRNA的效果成为可能. Randall et al就利用HCV的复制子细胞模型对于dsRNA抑制HCV RNA复制的效果进行了研究. 在Huh-7细胞系中，dsRNA对于HCV RNA的复制水平具有显著的抑制作用，而且是剂量依赖性的. 对于dsRNA作用的序列依赖性的特点进行研究，2株HCV变异株仅有3 nt的序列差别，只有dsRNA与作用的靶HCV RNA序列完全同源时才具有抑制作用，因此，dsRNA对于靶基因的表达抑制具有严格的序列特异性的特点. dsRNA对于HCV RNA抑制的作用效果是指数性的，在4 d之内，就可以降低HCV RNA的复制水平达80倍. 导入siRNA之后，可以使98 %以上的有HCV RNA复制的细胞不再有HCV RNA的复制，这些细胞中再也检测不到HCV的抗原表达和HCV RNA的复制. 这些研究结果表明，基于siRNA的抗HCV 治疗是十分有希望的.
有7个研究小组分别研究了以乙型肝炎病毒（HBV）表面（S）基因、核心（C）基因、前C基因和X基因为靶位的siRNA作用，抑制效率达42%～78%，鼠模型在体研究中以S基因和C基因为靶位的siRNA可使HBV表面抗原和e抗原降低至1/3。特别是S基因区的siRNA持续抑制达11d，而C基因区siRNA的抑制效率仅持续3～5d。
在抑制HBV复制研究中最有意义的结果是：RNAi除了有效抑制活跃复制的HBV，还能抑制非活跃复制的HBV，这一点不同于核苷类似物，因此，有可能发展成为与拉米夫定、阿德福韦等核苷类似物作用机制和位点不同的抗HBV药物联合用药。RNAi不能达到对病毒复制的完全抑制，限制了其作为单剂用药的可能性，因此，今后抗肝炎病毒的作用可能定位在与其它药物的联合用药与辅助用药中。但是，与其抗肝炎病毒治疗的应用并不矛盾，因为，抗生素在细菌感染中的应用经验表明，对不同靶点的药物联合作用将显著提高抗微生物的效果。同时，RNAi本身可以通过对多靶位的联合作用进一步提高抑制效率。RNAi发挥作用依赖于与靶序列完全同源，也需要多靶位RNAi联合应用，避免单个RNAi在病毒变异时失去作用。
但是，由于对siRNA的认识时间尚短，因此目前还没有具体的siRNA抑制乙型肝炎病毒的研究结果，但是从目前关于HCV的部分研究结果来看，从其他类型的病毒的抑制效果来看，siRNA还是具有希望的抗肝炎病毒治疗的新策略. 当然，由于肝炎病毒RNA分子在体内的二级结构特点，针对不同基因区段的siRNA的抑制作用效果也肯定有所差别，因此针对HBV、HCV基因序列的特点，还需要进行优化，寻找最为有效的抑制靶点. 作为一种新型的抗肝炎病毒的可能的策略，siRNA也具有其相当明显的局限性. 例如HBV和HCV基因序列高度变异，存在明显的基因准种(quasispecies)群，而siRNA对于靶RNA分子的识别，又是以碱基配对方式进行的，因此要想全面控制HBV、HCV的复制，我们就需要无数种序列不同的siRNA分子，显然是很难做到的. 因此，我们还必须针对这一特点进行深入细致的研究，克服这一困难，使siRNA抑制靶基因的表达策略更能切合临床抗肝炎病毒治疗的需要. 治疗性疫苗
早在1994年由法国巴斯德研究所首次进入临床研究的含有PreS2及S抗原的治疗疫苗，至今已完成Ⅱ期临床研究。结果发现无论用CHO细胞表达的PreS2/S抗原或酵母菌表达的重组HBsAg均未能显著降低血清HBV DNA。美国学者用CY-1899T细胞疫苗(含有HBV核心抗原第18-27位氨基酸免疫90名慢性乙型肝炎患者，虽然可诱生低度的细胞毒性T淋巴细胞应答，最高仅为10个裂解单位Lytic units，但并不与清除病毒相关。临床研究显示这一候选疫苗虽无严重不良反应，但对改善肝功能或降低病毒抗原均无显著作用。14名慢性乙型肝炎患者应用血源HBsAg-乙型肝炎免疫球蛋白复合物治疗慢性疫苗的结果显示，9名患者血清HBV DNA阴转，6名HBsAg阴转，2名出现抗-HBe，但患者的血清HBsAg无变化。改用酵母菌表达的重组HBsAg-乙型肝炎免疫球蛋白治疗性疫苗，现已进入I期临床研究。此外，应用重组表达PreS1/PreS2/HBAg作为治疗性疫苗的临床研究尚在观察中。最近，以色列与美国学者采用260U至40000U的人抗-HBs单克隆抗体给27名慢性乙型肝炎患者作静脉滴注。以抗体-抗原克分子比为1：2-1：20进行免疫，每月1次共12次，可致血清HBsAg降至不能测及的水平，且HBV DNA滴度也降低，患者无不良反应，但这一治疗作用是短暂的。德国学者用皮内注射HBsAg加口服拉米夫定加皮下注射IL-2，3个月后，7/9疫苗加拉米夫定及与2/5疫苗加IL-2加拉米夫定治疗者HBV DNA转阴，初步显示有一定治疗效果。
目前尚处于研究阶段的免疫治疗制剂主要为用病毒抗原加不同佐剂或用不同重组DNA免疫。用HBsAg-抗-HBs重组质粒DNA三重复合物型疫苗，用多肽-DNA组建针对人类白细胞抗原-A2.1和人类白细胞抗原11限制性肽加Th细胞表位及内浆网转位信号序列的DNA疫苗，以诱导T细胞或抗体HBsAg表位组成嵌合抗原的DNA免疫原。此外，还在携带HBV的黑猩猩中先用DNA免疫，再用重组含HBV DNA的金丝雀痘苗加强免疫。一周后，动物血清HBV DNA下降400倍并持续为HBV DNA阴性达186周，血清HBsAg滴度仅有短暂下降。应用CPG寡核苷酸加HBsAg阳性转基因鼠中可清除血清中的HBsAg并诱生特异的抗-HBs，且可调节肝内HBV mRNA的表达。
近来研究的进展主要有6点：(1)明确了乙型肝炎治疗性疫苗免疫耐受抗原为包膜还原，以针对HBsAg为耐受原的为首选候选疫苗。(2)候选疫苗应既可增强呈抗原呈递细胞的递抗原功能，又需促进DC-T细胞间的相互作用。(3)候选疫苗应能促进HBV特异的CD8杀伤细胞作用，但应尽量减少激活非特异CD8的作用。(4)治疗过程中，除及时了解HBV特异的CD8及所分泌细胞因子的情况，还应了解NKT及NK细胞的应答。(5)至今并未发现治疗性疫苗诱发肝细胞坏死等严重不良反应。（6） 建 立 检 测 CD 8 细胞及其功能及NK、T细胞功能的方法，在进行临床试验中予以随访，既可防止出现不良反应，又可促进基础结合临床研究，从而获得治疗性乙型肝炎疫苗有价值的科学资料。 HBV基因简介和变异
HBV的基因组是部分双链的DNA分子，长度约为3200bp。两条线性DNA链通过5’端间的226bp粘性末端构成环状结构，粘性末端的两侧各有一个11bp组成的直接重复序列，被称为DR1和DR2。在HBV颗粒内，HBV负链的长度是固定，有明确的5’和3’端，但HBV负链并不是闭环结构，在正链的5’ 末端附近，负链上有一小缺口(nick)，并且，负链的5’端有8～9bp的冗余，使这一小段成为3链结构。HBV多聚酶(polymerase, pol)与负链的5`端通过共价键结合。正链的5`端附着一个18bp长的寡核糖核苷酸，具有信使RNA(mRNA)一样的帽状结构。正链的3`末端长度不固定，因此大多数HBV基因组都含有一段单链的、长度不一的缺口区域(gap region)，长度为基因组长度的20～80%，这段区域可借助内源性的HBV DNA多聚酶补齐而成为双链。
HBV负链包含4个开放的读码框架(ORFs)，即Pre-S/S ORF、Pre-C/C ORF、Pol ORF和X ORF，分别编码包膜蛋白(HBsAg)、HBeAg 及核心抗原(HBcAg)、HBV多聚酶(Pol)和X多肽(HBx)。Pol ORF最长，Pre-S/S ORF完全与Pol ORF重叠，Pre-C/C ORF和X ORF也部分与Pol ORF重叠。由于HBV的一个ORF可含多个AUG(起始密码子)，因而可编码多种嵌套的有着不同N-末端的蛋白。
Pre-S/S ORF编码的HBsAg包括小(SHBs)，中(MHBs)，和大(LHBs)蛋白，它们都有糖基化和非糖基化两种形式。N-连接的糖基化作用和糖苷酶处理是形成病毒颗粒所必须的，但是亚病毒颗粒形成和病毒颗粒的分泌并不需要以上处理。SHBs由226个氨基酸组成，是3种HBsAg相关蛋白中含量最丰富的一种，含有较多的半光氨酸残基，它们相互交叉连接，形成构像性襻状结构，称为HBsAg的主要抗原决定簇，即“a” 决定簇，所有已知HBV分离株的HBsAg均含有此决定簇。“a” 决定簇还包括亚决定簇d / y和w / r，亚决定簇“d”或“y”分别指SHBs的122氨基酸为赖氨酸或精氨酸；亚决定簇“w”或“r”分别指SHBs的160氨基酸为赖氨酸或精氨酸。不同的亚决定簇诱导的抗HBs具有交叉保护性。
MHBs由前-S2和SHBs组成，前-S2是SHBs的N-末端延伸，长约55个氨基酸，其中心部分携带着主要的抗原表位，但与SHBs不同，其免疫表位为非构像依赖性，并且，MHBs也不是病毒颗粒组装和释放所必需的。MHBs第3～16位氨基酸区域能够与多聚人血清白蛋白(pHSA)结合，这种结合的意义目前还不清楚。由于MHBs在B细胞水平的免疫原性比SHBs强，有些国家已用动物细胞系生产含前-S2的HBsAg，并已作为疫苗应用于临床。
LHBs是由MHBs及其N-末端的一段108个或119个氨基酸长度(根据不同的亚型和基因型)的延伸组成，因此，LHBs包含前-S1，前-S2和S，呈糖基化形式。在成熟的病毒颗粒和HBsAg颗粒，前S 蛋白暴露于颗粒表面，S和前S2被前S1所遮盖。和MHBs不同，LHBs是病毒颗粒形成和感染性维持所必需的。 LHBs有着重要的B和T细胞的抗原位点，在病毒感染后的恢复和感染的保护方面起着重要的作用。在前S1编码区，主要的免疫表位位于27～35、72～78、95～107位氨基酸残基。在T细胞水平，LHBs的21～48、81～108位氨基酸残基也具有较强的免疫原性。
C ORF编码核心蛋白P21(HBc蛋白)，它是组成病毒核衣壳的主要多肽，表达形式为HBcAg。依据HBV基因型的不同，HBcAg由183、185或195个氨基酸组成。HBcAg含有2个完全不同的功能区，第1～144位氨基酸是32 nm核衣壳的装配区，HBcAg羧基端至150位氨基酸段是精氨酸富集区，类似于鱼精蛋白，可与核酸结合，与HBV的包装及复制有关。HBcAg羧基端的精氨酸富集区又可分为4个精氨酸丛集区，并且还包含1个细胞核定位序列。HBcAg含很多亲水区和带电荷的氨基酸，不含脂类，受细胞激酶的作用而部分磷酸化。精氨酸丛集区3与4之间的170～172位丝氨酸的磷酸化可阻断与核酸的结合，负性调节HBcAg在核内的定位。
HBeAg是HBc蛋白的分泌型，呈可溶性，被视为HBV的一种附属蛋白。前C序列在核心蛋白基因序列的上游，由前C 的AUG起始合成长为212个氨基酸的前C / C蛋白(P25或HBe蛋白)，它是HBeAg的前体蛋白,由核心蛋白和氨基端的29个氨基酸组成。P25起始部分的19个氨基酸起信号肽作用，为转运P25进入内质网提供信号。信号肽随后被宿主信号肽酶裂解，形成中间产物P22。P22羧基端的34个氨基酸被细胞蛋白酶切割，形成可分泌的15～18 kDa 的蛋白，即HBeAg。
HBeAg有至少两个B细胞的表位，即HBe1和HBe2，HBe1是线性的，HBe2为构像性的。HBe1和HBe2表位的分别位于核心氨基酸残基的第85和138位，HBcAg有2个免疫优势B细胞表位，位于在氨基酸残基74～83(HBc1)和107～118(HBc2)等区段，HBc1与HBe1呈共线性(colinearity)。已知的HBc蛋白的CTL表位分别位于氨基酸残基18～27位(HLA-A2限制的)和141～151位(HLA-A31和HLA-Aw69限制的)，91～110和111～125也是潜在的HLA-A2限制的CTL表位。HBc蛋白3个T辅助细胞(TH)的表位分别位于氨基酸残基1～20、50～69和117～131等区段。尽管HBe和HBc蛋白在功能及其转运等诸多方面上不相同，但在序列上大部分是相同的，在T细胞水平具有很高的交叉反应性。
Pol基因是最长的ORF，横跨了整个基因组的80%，并且与其它3个ORF相重叠。Pol蛋白翻译起自HBV前基因组RNA，其产物为816个氨基酸的多功能蛋白，包含4个区域。氨基端为末端蛋白(terminal protein，TP)，它可与HBV负链的5’端共价结合，引导HBV负链的合成。紧邻TP的是间隔区，尚未发现此区有特殊的功能。多功能蛋白的羧基端为RNA酶H，它可裂解逆转录过程中形成的RNA-DNA杂交体中的RNA。介于间隔区和RNA酶H之间的为RT区，其性质为RNA和DNA依赖的DNA聚合酶，催化HBV的逆转录和DNA链的合成。Pol编码至少2个T细胞表位，分别位于氨基酸残基107～115和227～235。目前认为，HBV DNA聚合酶除了作为功能蛋白在HBV复制中起作用外，它还是重要的结构蛋白。完整的DNA 聚合酶对于HBV前基因组RNA的包装是必要的。聚合酶优先包装其自身的模板(称为顺式包装)，变异导致的DNA聚合酶功能的消失并不影响其包装作用。
X ORF编码一段154个氨基酸长的多肽，分子量为17 kDa，称为HBx蛋白，分子量为17kDa，是HBV的第2种附属蛋白，在所有哺乳动物的嗜肝病毒中，HBx蛋白的序列较为保守。全长HBx的表达在HBV体外增殖过程中不是必要的成分，但是在体内感染过程中却是一个关键的要素。HBx蛋白通过直接与转录因子，如RNA聚合酶II的RPB5亚单位、TATA结合蛋白、ATB等相互作用，反式激活HBV和细胞基因的启动子。此外，HBx蛋白还可激活Ras/Raf/MAP激酶级联反应的信号转导途径。
HBx蛋白的另一个重要功能是，它在HBV介导的致癌作用中作为一个辅助因子发挥重要作用，但具体的致癌机制仍不明确。可能与HBx的反式激活作用引起的某些基因表达有关。已发现HBx的反式激活作用可灭活肿瘤抑制基因P53,引起细胞周期调节紊乱、中止P53依赖的细胞凋亡。26S蛋白酶体复合物是HBx另一个重要的靶位，可逃避免疫清除，抑制HBV抗原的呈递。
由于HBV Pol是一种逆转录酶，缺乏校正的功能，因此，HBV变异率比其它DNA病毒大约要高10倍左右，发生变异的频率大约为(1.4～3.2)×10-5核苷酸替换/位点/年。HBV发生变异的概率也受到患者所处的临床分期及所接受的临床治疗的影响，例如，是处于免疫耐受还是处于免疫清除清除期；是否接受免疫抑制治疗和器官移植等。
在一个HBV感染者的血清中，在HBV准种池内占多数的病毒群通常成为优势株。宿主免疫系统的选择性压力、重叠的读码框架所引起的限制性、存活能力、病毒的复制潜能等维持了HBV优势株的稳定性。此外，病毒复制的数量和速率对优势株的稳定性也是十分重要的影响因素。多数研究结果表明，血清中总的病毒载量可高达1011病毒颗粒/ml，血HBV池的半衰期大约为1～2天， 每日新产生病毒颗粒的数量可能高达1011病毒颗粒。如此高的病毒载量和更新率以及较低的复制忠实性(replication fidelity)等均可影响变异的产生和HBV准种池的容量。
变异病毒的复制必须有可用的复制空间(replicaton space)。变异株是通过占据原来野毒株的位置而获得复制空间的，此过程的前提是原来野毒株的消失，而原来野毒株能否消失则受其本身的复制适应性、肝细胞的更新、增殖等影响。复制空间可以理解为肝脏容纳新的HBV ccc DNA分子的潜力。新生的ccc DNA分子只能在未感染的细胞、更新的肝细胞、核内ccc DNA已消失的感染肝细胞中合成。所以，一株病毒成为优势株首先要增加其cccDNA合成，然后才能实现病毒量的扩增。换句话说，只有在拥有新的复制空间的前提下，HBV耐药株在肝内的数量才会增加。
1、BCP，前C区和核心区基因的变异
实验证实，有两组变异可造成HBeAg表达的减少或终止。第一组变异的位点位于前C区基因的nt1896位，G1896A单个碱基的替换造成了翻译终止密码的产生(密码子28由TGG变为TAG；TAG为终止密码子)，而密码子28是前C区基因内的ε结构中的倒数第二个密码子。ε结构是一个高度保守的茎襻结构，其中的nt G1896和茎襻结构中的nt1858位形成碱基配对。在B，D，E，G和某些C基因型的HBV前C区茎襻结构中，第1858位碱基是一个T(胸腺嘧啶)(表1),发生G1896A变异后，第1858和1896碱基形成T-A配对，有利于稳定ε结构，因此，这些基因型HBV容易发生前C区G1896A变异。与之相反，A，F和某些C基因型HBV很少发生前C区终止变异，其原因是这些基因型HBV的第1858位的碱基是C(胞嘧啶)，与1896位碱基G一起，形成了稳定的G-C碱基配对。发生G1896A变异时，变异株前C区所编码的产物在解脱信号肽后，只遗留10个残基地短肽，不能再产生HBeAg，但HBV可继续复制，形成持续的病毒血症。由于HBcAg与HBeAg有交叉免疫原性，虽HBeAg呈阴性，却仍可引起宿主持续的抗HBe应答。
其它的3变异(位于1817，1874和1879位碱基)可造成HBeAg的截断。涉及起始密码子的变异(第1814，1815，1816位碱基)也有报道。在前C区G1896A终止变异株，G1899A变异也很常见。
早期的研究提示，HBV前C区终止变异可能与重型乙型肝炎和暴发性乙型肝炎(FH的发生有关。然而，这一变异也可见于无症状的HBV携带者。直至目前，HBV前C区终止变异与暴发性肝炎以及乙型肝炎严重度之间的关系依然不能被确认。
第二组变异发生在BCP区，如A1762T与G1764A联合变异。根据HBV基因型的不同，A1762T与G1764A联合变异可单独或与前C区变异一起出现(见表1)。A1762T与G1764A的双变异可导致HBeAg的产量减少70%。BCP的变异可减少其与肝脏特异的转录因子的结合，从而导致前C和C mRNA的转录减少，最终造成前C区蛋白的减少。但是，这一变异并不影响HBV前基因RNA的转录和核心蛋白或多聚酶蛋白的翻译。由于去除了HBV前C区蛋白对HBV复制的抑制作用，与HBV前基因RNA相近的前C/C mRNA的转录减少，因此，BCP变异株的复制能力可能有所增强。和前C区变异株一样，BCP变异株也没有被确认为潜在的毒力标志。
与HBeAg阳性慢性乙型肝炎相比，HBV前C区变异或BCP变异株所致的HBeAg阴性慢性乙型肝炎对抗病毒治疗的应答有所差异。HBeAg阴性慢性乙型肝炎对α干扰素的疗效低于HBeAg阳性慢性乙型肝炎，α干扰素治疗后12个月的持久应答率平均为24%，停药后5年内的复发率达50%以上。而HBeAg阳性慢性乙型肝炎HBV DNA的转阴率为37%，HBeAg转阴率为33%。对HBeAg转阴者随访4～8年，80%～90%患者的HBeAg可维持阴性。对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，推荐的疗程为16～24周。对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者，推荐的疗程至少为12个月。
拉米夫定对HBeAg阴性慢性乙型肝炎的疗效也不理想， 拉米夫定治疗1年后，HBV DNA转阴率分别为65%(bDNA法)和39%(PCR法)，但90%的患者在停药后出现复发。
C基因区相当保守，但在慢性HBV感染中，C基因的变异可能并不少见。C基因的变异绝大部分集中在aa48～60、aa84～101、aa147～155 3个区段中，较常见的变异包括L60V、S87G、I97L等变异。其中，I97L变异相对多见，且与病变的进展有关。此外，C基因中段还可以发生缺失变异，仍能产生HBcAg,但可降低HBV的复制。
核心基因含有B细胞和杀伤性T细胞(CTL)的表位。在慢性乙型肝炎的病毒清除期，这些表位变异的HBV容易被选择出来，成为逃避变异株。Akarca和Lok已经证实，核心基因突变的频率与前C区终止变异、HBeAg阴性和活动性肝病相关。由于HBV感染时的肝细胞损伤是免疫介导的，而HBcAg是免疫攻击的靶抗原，因而推测C基因变异可能与病变活动和感染清除相关。有学者分析了慢乙肝患者血清中HBV C基因第130位氨基酸(T、B细胞共同的表位)变异与肝损害关系，结果发现慢乙肝患者病情加重、ALT 升高时变异株占优势，而在ALT高峰下降后野毒株占优势，而慢性携带者野毒株始终占优势。C基因变异与细胞免疫之间关系仍需作更深入的研究。
2、X基因的变异
X基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区发生变异将影响到病毒的转录和复制。X基因内的C基因调节序列区包括多个调节元件，包括DR1/DR2、负链缺口、增强子II和目前研究较多的核心启动子(CP)。CP由核心上游调节序列(CURS)和基本核心启动子(BCP)两部分构成，CP上游为负性调节元件(NRE)。X基因变异可能影响到控制HBV复制的调节元件，如BCP和EnH2。因为BCP包含nt1742～1802的区域，与X基因的读码框架重叠，因此，BCP的A1762T与G1764A联合变异也同样会引起X蛋白xK130M和xV131I变异。
此外，一种新的HBx变异株已经在肝细胞肝癌(HCC)患者血清中发现，这种变异株可增加克隆的增殖，减少细胞的凋亡，提示可能与肝癌的发生有关。
3、包膜基因的变异
前S序列是整个基因组中异质性最高的区域。通过对慢性HBV携带者血清中的HBV DNA序列进行分析，已经发现前S区基因存在点突变、缺失和基因重组等。不能合成前S2蛋白的HBV毒株也较常见，并且常为优势株。前S2区与Pol蛋白的间隔区重叠，而后者并不是Pol活性所必需的，因此，前S2区变异并不影响Pol的活性。
大多数的乙型肝炎疫苗包含226个氨基酸残基组成的HBsAg。针对HBsAg 主要亲水区(major hydrophilic region, MHR)的免疫反应可诱导免疫保护作用。在MHR内有一个免疫优势表位,称为“a”决定簇，位于HBsAg氨基酸序列中的124～147位，是HBV各亚型的共同决定簇，有一定的空间构型，由被动免疫产生的抗体90%是针对“a”决定簇，此种抗体可对所有亚型的HBV感染提供保护性免疫。“a”决定簇内的几个、甚至单个氨基酸的改变，将破坏构型的稳定性，从而改变其抗原性和免疫原性。
在疫苗诱导的抗体所产生的压力下，可出现MHR内的变异。目前已证实，这种S基因变异株可引起免疫逃避。最先发现和最常见的变异株为HBsAg 的G145R毒株，于11年前首先在意大利被发现，随后在中国大陆、台湾、日本、泰国、巴西、新加坡、美国等也被陆续发现。台湾的研究发现，在HBV DNA阳性的儿童中，HBsAg的 “a”决定簇变异率在1994年已达28.1%。S基因G145R变异株较原型毒株有生存优势，体外实验证明，G145R突变株的免疫原性、与原型毒株抗HBs的结合力均发生明显变化。“a”决定簇内的其他氨基酸变异，如126位、129位变异也可引起类似的免疫逃避现象。由于HBV免疫逃避变异株的出现，部分儿童即使接种了乙肝疫苗，仍可能发生HBV突破性感染(Breakthrough infection)，提示未来的乙肝疫苗应包括野毒株和变异株的S蛋白。但目前认为，HBV逃避变异株尚不足以对已在进行的乙肝疫苗接种计划构成威胁。
这种变异株的产生机制目前仍不明确，有人认为这种变异株是母亲体内的少数毒株经垂直传播给婴儿后，经免疫选择成为婴儿体内优势株；也有人认为母亲体内无这种变异株，是原型毒株在婴儿体内免疫压力下发生变异的结果。随着疫苗的广泛推广，促使HBV发生变异的免疫压力逐渐增大，变异发生机会增加。幸运的是，G145R突变株表达的HBsAg仍能为多数常规诊断试剂所检出。
由于抗HBs可对易感者提供保护性免疫，国际上普遍采用HBIG预防移植后肝脏再感染HBV。但近年来发现不少患者经HBIG治疗后仍然感染HBV，经研究发现此与HBV S基因变异有关，包括S基因第20、44、114、130、145、184和188位氨基酸等多处变异。因此，S基因变异除了影响主动免疫的效果，也会影响HBIG的被动免疫疗效。此外，研究还发现，HBIG治疗持续时间的长短与S基因变异发生率之间有一定关系，HBIG造成的免疫压力可促进S基因变异的发生。在这种免疫压力消失后，这种变异株会逐渐消失，原型毒株可再次成为优势毒株。
S基因变异还与HBsAg阴性慢性乙型肝炎(隐匿性乙型肝炎)的发生有关。在广东地区，对抗HBc阳性的人群进行PCR检测，发现3%人群属于HBsAg阴性HBV感染者。但在我国没有对这种变异的发生率及其对肝脏病情的影响进行大规模的研究。HBsAg阴性HBV感染是临床及流行病学面临的一大难题，是导致临床漏诊及献血员筛检错误的原因之一。
值得指出的是，隐匿性乙型肝炎仅部分是S基因变异引起的，而有些病人在HBsAg “a” 决定簇内未发现变异，HBsAg阴性的原因还与诊断试剂的敏感性、HBsAg水平等有关。
4、HBV pol的变异
过去，HBV Pol氨基酸序列的位置命名是从P基因的起始密码子开始的。由于不同基因型P基因编码的Pol氨基酸长度不一致，导致HBV Pol氨基酸位置的命名一直较为混乱。如A基因型HBV的P基因编码845个氨基酸，而B和C基因型的P基因编码843个氨基酸，D基因型的P基因编码842个氨基酸。这样就导致了同一个氨基酸在不同的基因型中的命名位置不一致，不利于相互交流。如YMDD基序中的M，在A基因型中位于552位，而在B和C基因型中为550位，在D基因型为539位，在E和G基因型为549位。为了消除这种基因型之间的差异，有学者重新对Pol进行了命名，命名原则如下：不同的HBV毒株P基因TP(末端蛋白)和间隔区在不同基因型中长度不一致，而所有HBV毒株的RT区长度均为344个氨基酸，并起始于一个保守序列EDWGPCDEHG。基于这样一个特点，对Pol RT区进行单独命名已成为可能。
目前认为，HBV对核苷类似物耐药性的产生与HBV P基因变异有关，并且HBV P基因变异是多位点的，以C区YMDD基序的变异最为重要。拉米夫定(Lamivudine)是目前公认的治疗乙型肝炎的三种药物之一，在短期内可使HBV DNA水平下降，肝功能恢复正常，肝纤维化程度得到改善。但拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的主要缺陷之一是易产生耐药性。随着治疗时间的延长，耐药率明显增加。亚洲的临床研究数据显示，拉米夫定治疗1～4年的基因耐药率分别为14%、38%、49%、66%。出现耐药后多数患者出现ALT的反跳，偶尔可发生肝功能失代偿。耐药性的产生是HBV RT区YMDD基序变异所致。使用新的命名法，拉米夫定相关的HBV耐药株的变异位置和类型为rtM204I/V(C区)± rtL180M(B区), 将含有上述变异的全长HBV DNA转染细胞，发现这类耐药毒株的复制能力下降。最近，还发现一种新的变异类型，即YSDD变异或rtM204S变异(以往报告的基本是YVDD或YIDD变异)，这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月的患者的血清中发现的。体外转染研究也证实了这种YSDD变异株对拉米夫定耐药。
HBV YMDD变异株的复制能力并不都是减弱的。Bock等最近发现，YMDD变异伴“a”决定簇内变异时，病人可出现病情恶化，体外研究结果显示，这种联合变异可使病毒的复制能力明显增强，与以往的研究结果不一致。Ono等的研究结果也提示YMDD基序之外变异可补偿HBV YMDD变异株的复制缺陷，使HBV的复制增强。
由于HBV Pol基因的读码框架和S基因完全重叠，HBV聚合酶RT区变异可同时引起S基因变异。最近，国外已有研究发现，拉米夫定相关HBV变异株HBsAg与抗HBs的结合力明显降低，尤其是伴“a”决定簇内变异时，HBsAg与抗HBs的结合力的降低更明显。当HBsAg与抗HBs的结合力明显降低时，可成为免疫逃避变异株，导致乙肝疫苗接种失败。由于我国每年有大量乙肝患者服用拉米夫定，是否会产生HBsAg “a”决定簇内变异，以及这种变异株是否会发生免疫逃避，是一个急需阐明的问题。
泛昔洛韦(Famciclovir)是另一类的核苷类似物类抗HBV药物，它通过活性代谢产物－喷昔洛韦三磷酸盐抑制HBV DNA聚合酶。与lamivudine不同，泛昔洛韦耐药株的P基因变异多位于B区，变异类型为rtL180M。体外试验证实，rtL180M变异株可导致HBV复制功能的下降，对Famciclovir产生抗药性。
最近，Angus等已从1例接受Adefovir治疗96周、具有临床和病毒学耐药证据的患者血清中分离到1株HBV耐药株，序列分析发现HBV RT的D区出现rtN236T变异。经体外转染试验证实，含rtN236T变异的HBV毒株对Adefovir的敏感性显著下降。
其他核苷类似物，如Entecavir等在治疗慢性乙型肝炎过程中，尚未发现肯定的耐药变异株。
有关P基因自然变异(与药物选择性压力无关)及其意义的研究报告较少。最近，Lin等报道，在从两例慢性乙肝患者血清中分离得到两株复制能力差异显著的全基因组HBV DNA基础上，采用构建高低复制株聚合酶功能区嵌合体及PCR定位点突变的研究策略，分析聚合酶的基因结构与复制性增强的机制，发现位于逆转录酶功能区(RT区)的HBV DNA聚合酶第652位氨基酸Ser-->Pro突变是导致HBV复制增强的决定性因素。蛋白三维结构模拟分析证实652位氨基酸Pro-->Ser突变可使聚合酶的活性受损，表明HBV DNA聚合酶652位氨基酸是影响HBV复制的新的功能位点，其临床意义有待进一步了解。作为HBV复制的主要功能区，P基因变异及其意义的研究在今后应引起足够的重视。 主任提出了好话题，我曾经翻译过一篇相关文献，贡献给大家，以供参考。
乙肝治疗新方法
前言
目前，有三种治疗乙肝的方法疗效已得到大家认可，还有一些更多的治疗方法正在进行临床试验，并且大都已进入试验二三期。临床上所反应出来的药物治疗后长期应答率不够理想、越来越多的耐药、以及乙肝病人这一特殊人群的需求等实际情况，使得探索治疗新途径、新方法尤显重要。一些乙肝病毒特有的生物合成过程已被阐明，可将其作为小分子药物的潜在作用靶位，从而可针对性制定小分子药物开发计划（图表），免疫调理治疗也可能成为有效的辅助治疗方法；未来对乙肝更有效的治疗，极有可能是采用针对多重靶位多种药物的联合治疗，从而达到持续清除病毒的目标。
核苷和核苷酸类似物聚合酶抑制剂
五种有抗乙肝病毒活性的核苷或核苷酸类似物聚合酶抑制剂已投入临床应用的有三种：拉米夫定、adefovir dipivoxil（阿地福韦）（证实对乙肝治疗有效）和tenofovir disoproxil fumarate（泰诺福韦）（证实对HIV有效）。
其它几种核苷类似物对乙肝病人的应用情况正在评价过程中：
Entecavir（BMS 200475）
Emtricitabine（FTC）
Telbivudine（LdT）
Elvucitabine（Beta－L－Fd4C or ACH-126443）
Valtorcitabine（val-LdC）
Clevudine(L-FMAU)
除entecavir外，所有这些复合物均为左旋结构核苷类似物。这使得让人担心那些对拉米夫定产生耐药变异的病人亦对其它左旋核苷类似物耐药，理论上可导致不同程度的产生交叉耐药。正在进行的临床试验将决定这些制剂的临床疗效。
Entecavir
Entecavir是一处于临床试验研究后期的药物，三个正在进行的三期临床实验分别比较了该药与初次应用拉米夫定、拉米夫定耐药患者中应用此药的疗效。一个二期临床试验中，169例未曾应用核苷类似物的乙肝患者，经24周entecavir治疗后，HBV DNA的下降较之与拉米夫定治疗组为显著。另一个临床试验，对181例拉米夫定治疗失败的患者予以应用三种不同剂量的entecavir与继续持续应用拉米夫定两种疗法的疗效作了比较评价。结果显示entecavir治疗组HBV DNA载量的下降幅度和ALT的复常率均优于拉米夫定治疗组。应用最大剂量的entecavir（1.0mg/day），治疗48周HBV DNA载量平均下降5.11log10，并且并无突破所致的病毒血症发生。应用entecavir1.0mg/day的受试者，第48周，26％检测不到HBV DNA（PCR法），而拉米夫定治疗组只有4％检测不出HBV DNA。然而，HBeAg的阴转和其血清转换，几种治疗方法均未见显著差异。在48周entecavir治疗期间未产生耐药变异，并且entecavir的活性不受拉米夫定耐药的影响。
Emtricitabine
Emtricitabine在结构上与拉米夫定相似，已经显示有潜在抗乙肝病毒的活性。一个二期临床试验显示，98例慢性乙肝患者投以三种Emtricitabine剂量中的一种治疗48周，续以开放标签的Emtricitabine应用。约有1/3的受试者在先前的试验中应用过Emtricitabine。治疗48周观察结果示，接受大剂量Emtricitabine（200mg/day）的受试者，61％达到血清HBV DNA检测不出的水平，50％HBeAg消失，23％的受试者获得e抗原－e抗体血清转换。Emtricitabine耐药变异的发生率，治疗1年，大剂量组（200mg/day）大约为6％，小剂量组为12％。不良事件大多较轻微，只有5例病人出现严重的不良事件，其中一例（紫癜性皮疹伴有血尿）病人，考虑与试验药物可能相关。
Emtricitabine治疗慢性乙肝的作用有可能因与拉米夫定有交叉耐药而受到限制。不过，由于它也有较强的抗HIV活性，美国食品及药物管理局有可能在2003年批准其应用于临床治疗。
Telbivudine
临床试验已初步显示， Telbivudine在体外及动物（美洲旱獭）模型上有抗乙肝病毒活性。在一从小剂量到大剂量的临床试验中可以看到，每天应用25－400mgTelbivudine，4周后受试者HBV DNA水平下降2.4－4.0log10倍。进一步的研究尚在进行中。
Elvucitabine
Elvucitabine有可能成为最佳的抗HBV核苷酸类似物抑制剂。该药兼具抗HBV和HIV双重活性，在这两种疾病中的应用一直在同步探索开发。在体外试验中显示该药活性较其它同类药物强10倍以上，并且血清药物浓度可达到超过拉米夫定耐药病毒的IC50水平。其药代动力学特点支持每日一次给药即可。
Valtorcitabine
二期临床试验对Valtorcitabine的用药剂量作了研究评价，以每天50—200mg的剂量治疗28周，接受最高剂量的病人HBV DNA水平下降3.6log10，并且无明显不良事件发现。
Telbivudine和Valtorcitabine的联合应用研究已在计划中。
Clevudine
Clevudine是一HBV DNA聚合酶抑制剂，在体外EC50=0.02-0.15UM，对鸭及美洲旱獭乙肝模型有抗病毒活性。临床试验给予Clevudine1至2剂的递增量治疗4周，结果显示该药具有病毒抑制作用，并且抑制作用可持续到停药后6个月。以100mg每天，治疗至42周时，抑制作用达高峰，HBV DNA载量下降3.4log10copies/ml，未发现耐药变异。27％的受试者HBeAg消失，18％出现e抗原－e抗体血清转换。试验动物对200mg/d以下的剂量耐受性良好。其最佳应用剂量的研究尚在进行中。
病毒壳体化抑制剂
目前已开发出一些药物，其抑制HBV的机制与核苷和核苷酸类似物抑制剂不同，作用靶位不在病毒聚合酶。这些药物有些是phenylpropenadime的衍生物（AT/61,AT/130）。这类药物的作用机制是通过阻止或干扰病毒的核酸衣壳形成过程。这些药物虽在短期内不能应用于临床，但早期的临床前期研究资料证明，抑制HBV亦可不通过抑制病毒聚合酶这一传统作用靶位，而可另辟蹊径。
其它种类的新型药剂亦有报道在体内外均有HBV抑制效应。有些通过阻止病毒核衣壳的形成得以发挥作用。这类药物的潜在临床应用当前正在研究中。
病毒装配及释放抑制剂
HBV表面抗原的糖基化对于病毒核衣壳的出胞和包封是极其重要的一个环节，还涉及内质网和高尔基体等细胞附属体。这一过程需许多酶类的作用，干扰这些酶的活性对病毒体的分泌有很大的影响。
目前已有一些α－糖苷酶抑制剂的相关报道。病毒体对这些抑制剂产生耐药相对不太可能，但是这一抑制作用过程对宿主有关的其它系统是否具有毒性尚待进一步研究定论。
基因治疗
目前已有一些基因治疗方法已开发成功，包括核酶、抗过敏寡核苷酸、干扰肽及治疗性DNA疫苗。
最近，小干扰RNAs（siRNAs）的出现更是提高了大家对基因治疗的兴趣。siRNAs导入人类细胞可以沉默特异细胞mRNAs而没有出现非特异性反应。对于这些分子的转移、稳定性、毒性、耐药性的相关报道尚需慎重评价。
免疫调理治疗
免疫调理的目的是提高宿主对HBV特异性免疫应答水平，从而阻止病毒的复制。α干扰素及其它一些这类药物已被批准应用于临床。
Pegylated interferon（聚乙二醇干扰素）
聚乙二醇干扰素（Pegylated interferon）治疗慢性丙型肝炎的临床试验结果显示较标准干扰素更具优势，这激发了大家在慢性乙肝中也应用聚乙二醇干扰素的兴趣。由此，在亚太地区的一个2期临床试验，194例慢性乙肝病人，e抗原阳性，未曾应用过干扰素，应用聚乙二醇干扰素 α－2a（90ug、180ug或270ug，每周一次）或者标准干扰素α－2a（4.5MU，每周三次），连续治疗24周，然后再随访检测24周。试验终点设为e抗原消失、HBV DNA<500000拷贝以及ALT复常。结果显示，标准干扰素组12％的受试者达到以上要求，而聚乙二醇干扰素治疗组的反应为：90ug、180ug、270ug三组分别是26％、28％、19％。正如预期所望，低滴度e抗原及低水平HBV DNA的患者对聚乙二醇干扰素反应较好，可作为疗效预测性因素。然而，聚乙二醇干扰素对传统治疗困难的受试病人亚群的治疗较之与标准干扰素有更为持久的疗效，譬如ALT基线水平低者、治疗前高HBV DNA水平者以及肝硬化或肝纤维化患者。
有两个三期临床试验正在进行，试验对e抗原阳性和阴性慢性乙肝患者单用聚乙二醇干扰素（180ug/w）、拉米夫定、两者合用三种治疗效果进行比较观察。
α胸腺素
α胸腺素是来源于胸腺的28氨基酸多肽，可促进T细胞的成熟，加强T细胞的作用。大量研究表明胸腺素对部分HBV感染患者有效，可使ALT复常、抗－HBe血清转换以及血清HBV DNA减少。事实上，在数个亚洲国家胸腺素已被批准应用于HBV 的治疗。
然而，据文献报道，这药极具不确定性，有些研究结果示该药无何益处，亦有报告有80％完全应答率。显然，胸腺素的疗效尚需大规模的临床试验来进一步证实、澄清。
白介素－12
白介素－12作为一个细胞因子，可促进TH1抗病毒度免疫应答。该药在动物模型尚亦显示具有抗病毒作用，并且在最近进行的一早期临床试验中观测到，该药可使部分入选患者血清HBV DNA在治疗初期即有明显降低。该药的毒副作用及其安全性有待更大规模的临床试验来明确。
树突状细胞疫苗
树突状细胞作为抗原提呈细胞在激发抗病毒免疫应答中起及其重要的作用。利用HBV特异蛋白在体外预先制备的DC而制成的自体疫苗可望成为未来的治疗办法。虽然DC疫苗的研究刚起步，但是，这种治疗方法在理论上可克服免疫耐受，并可激发多重特异性抗－HBV免疫应答。当然，还需要进一步研究、评价。
联合疗法
联合治疗，如核苷酸类似物与免疫调节剂如α－干扰素的联合应用治疗乙肝有以下一些吸引人的优点和特征（表－2）。首先，初始治疗的目的是尽可能快而多的减少病毒载量，而核苷酸类似物的联合治疗在动物模型中已显示出了HBV DNA下降率的增加。另外，联合治疗有可能减少耐药机会，尤其是两类药物的作用机制如呈互补性，更是如此。正如HIV感染的治疗一样，未来HBV更有效的治疗方案将可能是针对不同作用靶位的多种药物的联合治疗。由于联合治疗可充分考虑各种联合用药的安全性、有效性以及病人是否能够充分耐受等因素，因此可降低耐药和治疗失败的风险。
摘要――临床实践推论
1 当前，FDA批准的乙肝治疗方法的不足之处有：远期应答率不够理想、耐药现象越来越突出、不能满足乙肝患者这一特殊人群的需求等。这使得新方法的探索尤显重要、迫切。
2 entecavir（恩替卡韦）较拉米夫定更为有效，对拉米夫定耐药的毒株亦具活性。
3 emtricitabine具有效的抗病毒活性，但其作用因与拉米夫定有交叉耐药而受限。
4 telbivudine和valtorcitabine在体外都具抗病毒活性，二者的联合应用研究正在计划中。
5 elvucitabine也许是当前在开发的最有效的抗－HBV核苷酸制剂，也有抑制拉米夫定耐药毒株的潜在可能。
6 clevudine有持久的抗－HBV活性，即便在停药后4周仍然有较强的作用。
7 作用于病毒核酸壳体化过程、核衣壳的形成、表面抗原蛋白的糖基化、α糖苷酶等的研究性药物都尚在临床前期开发，基因治疗亦在临床前期开发。
8 聚乙二醇干扰素（peginterferon）治疗乙肝也许较标准干扰素更有效，正在进行单独应用和联合拉米夫定治疗的临床试验。
9树突状细胞作为抗原提呈细胞在激发抗病毒免疫应答中起及其重要的作用。利用HBV特异蛋白在体外预先制备的DC而制成的自体疫苗可望成为未来的治疗办法。虽然DC疫苗的研究刚起步，但是，这种治疗方法在理论上可克服免疫耐受，并可激发多重特异性抗－HBV免疫应答。当然，还需要进一步研究、评价。
10 在几个亚洲国家，α胸腺素已被批准应用于乙肝的临床治疗，并且有报道在部分病人具有有效的免疫调理作用，虽然研究结果极其不一致。
11 未来的治疗策略可能是多种药物的联合应用。 我对抗HBV新药相关资料作一个整理：
1、抗乙型肝炎病毒新药的体外研究进展
[url]http://www.bioon.com/drug/advance/therapy/200408/63233.html[/url]
2、抗HBV病毒活性成分新菌株被发现
[url]http://www.chinagbkf.com/fzdt/d51.htm[/url]
3、抗乙肝新药恩替卡韦
[url]http://www.hepat.cn/2004/9-5/162714.html[/url]
4、抗乙肝新药阿德福韦
[url]http://vip.6to23.com/jk300/ganbingyongyao0.1.htm[/url]
5、“阿德福韦酯 ”研究进展相关情况
[url]http://www.jinhf.com/xyjs/023.htm[/url]
6、抗肝炎新药百赛诺安全性好、疗效稳定
[url]http://fm365.39.net.cn/Professional/Drug/New/200208/13995120020809.htm[/url]
7、国家一类抗肝炎新药—百赛诺最新上市
[url]http://vip.6to23.com/jk300/new_page_1.149.htm[/url]
8、海洋新药-抗乙肝新药研制获新进展
[url]http://www.edu.cn/20011205/3012861.shtml[/url]
9、广东成功研制抗乙肝新药 预计明年底上市
[url]http://www.39.net/HBV/cydt/50674.html[/url]
10、新药“蕨麻素片”
[url]http://www.302lab.com/xyzl.html[/url]
11、乙肝新药LDT临床试验将在国内开展
[url]http://www.39.net/HBV/cydt/22497.html[/url] 干扰素与核苷类药物疗法治疗乙型肝炎的优势与劣势
1. 核苷类药物
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优势 劣势
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口服给药 需要长期治疗才能达到抑制病毒的效果
不良反应少 可引起耐药性病毒变异
可用与失代偿性肝硬化和原伴 与干扰素的疗效不同，罕见HBsAg消失
肝移植术后
比干扰素花费少* 停药后有20～25%的患者发生ALT反跳
*以1年治疗的花费计算
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2. 干扰素α
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优势 劣势
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疗程短，16～32周 价格较贵
30～35%的HBeAg阴转率 有许多患者没有疗效
5～8%患者HBsAg消失 有明显的不良反应
没有耐药性病毒变异的报告 在失代偿性肝硬化患者中应用有一定风险
具有免疫调节作用
*长效干扰素比普通干扰素的疗效更佳
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在乙型肝炎的治疗中，核苷类药物的出现是一个较大的进步，但是长期单一的药物治疗可能引起耐药，然而也没有足够的数据证明联合用药治疗可否增加疗效。一些对乙型肝炎病毒复制抑制力更强的新药正在开发之中，已经能够证明这些药物的临床疗效更佳和/或更不容易引起耐药。干扰素在慢性的治疗中起作用，其疗效与乙肝病毒的基因型有一定的关系。从理论上看，长效干扰素与一种或多种核苷类药物联合治疗可能提高抗病毒的疗效。 我引用一篇来自“搜药在线”里面的，对有的战友希望有用：
抗病毒药物的研究进展综述
人类致病病毒是一种核酸颗粒, 结构极为简单, 多数缺乏酶系统, 只能依赖宿主细胞复制其核酸和蛋白质, 然后装配成病毒颗粒而增殖。病毒感染引起多种疾病，严重危害人类的健康和生命。据不完全统计，约６０％流行性传染病是由病毒感染引起的。迄今，全世界已发现的病毒超过３０００种，而且新的病毒还在不断被发现。２００２年８月在巴黎召开的世界病毒学大会上，由国际病毒分类委员会提出的第７份报告收录了３６００多种病毒，其中使人类致病的病毒有１２００多种，分为２９个科，７个亚科，５３个属。
对病毒性疾病的治疗至今仍缺乏专属性强的药物，临床上常用的药物主要有如下几类：抑制病毒复制的抗病毒药；增强机体免疫功能的免疫调节剂；针对临床症状的止咳、镇痛、解热和消炎等治疗药；防止继发感染的抗感染药；预防病毒感染的疫苗及阻断病毒传播的消毒药等。
本文主要介绍抑制病毒复制的抗病毒药。抗病毒药在某种意义上说只是病毒抑制剂（virustatic agentis），不能直接杀灭病毒和破坏病毒体，否则也会损伤宿主细胞。抗病毒药的作用在于抑制病毒的繁殖，使宿主免疫系统抵御病毒侵袭，修复被破坏的组织，或者缓和病情使之不出现临床症状。至今，某些病毒性疾病如脊髓灰质炎和狂犬病还没有抗病毒治疗药，只能靠疫苗预防，一旦错过防疫期，后果十分严重。
近年来新的抗病毒药不断出现, 但是病毒性感染的发病率仍持续不衰, 特别是20 世纪80 年代艾滋病及其病原病毒的出现, 对抗病毒药的研究开发提出了紧迫的要求, 随着临床应用的日益广泛, 医生和患者对抗病毒药的要求越来越高, 因此抗病毒药的研究成为当前国际研究的热点之一。本文针对发病率高、危害大的病毒,如乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒等， 根据类型及作用特点, 对抗病毒药物进行综述。
1、抗乙型肝炎病毒(HBV)药
肝炎病毒感染是当今国际公认的治疗学难题, 在肝炎病毒中的乙型(HBV)、丙型(HCV) 和丁型(HDV)在急性感染后有80% 以上会转为慢性, 其中20% 若持续感染有可能发展成肝硬化, 其中的1%～5% 转为肝癌。
乙肝病毒(hepatitis B virus ,HBV) 为嗜肝病毒,全世界超过3 亿人受到乙肝病毒的感染,患上慢性肝炎,进而发展成肝硬化,甚至肝癌。该病毒感染为排名第九的世界范围内最常见致死病因。
国外对治疗病毒性肝炎新药的研制侧重于开发抗肝炎病毒药。 80年代曾进行试验的阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿昔洛韦、齐多夫定因疗效不佳，毒性反应大，在国外已不再用于治疗乙肝。近几年各大型企业利用已建立的肝癌细胞株，肝炎病毒转染细胞株或转基因细胞株和转基因小鼠肝炎动物模型遴选抗乙型和丙型肝炎病毒药，开发了多种核苷类药物，对HBV有明显的抑制作用。如拉米夫定（lamivudine）、泛昔洛韦（famciclovir）、洛布卡韦（lobucavir）、阿地福韦（adefovir dipivoxiil）、FTC（二脱氧氟硫代胞嘧啶）、FMAU（氟甲阿糖尿嘧啶）、FDDC（氟二脱氧胞嘧啶）、BMS 200475（环氧羟碳脱氧鸟苷）。1998～2002年国外学者先后对30多个品种进行临床前实验研究。近期进入II～III期临床试验的药物有21个，在这些试验药物中，用于抗乙肝病毒的试验药物多数来自抗HIV逆转酶抑制剂和抗疱疹病毒DNA聚合酶抑制剂，这两种病毒酶的抑制剂也是抗乙肝病毒的靶点；而用于抗丙肝病毒的试验药物多数来自广谱抗病毒药或RNA病毒抑制剂以及具有抗病毒活性的免疫调节剂。
1. 1 核苷类药物
以核苷为基本构架, 通过碱基或戊糖环的改变而产生一系列核苷类似物, 具有明显的抗HBV活性, 曾成为抗HBV 药物研究的热点。这类药物可分为嘧啶核苷类似物和嘌呤核苷类似物。前者如拉米夫定，后者如喷昔洛韦(penciclovir)、阿特福韦(adefovir)及其衍生物等。
拉米夫定由Biochem Pharma公司开发, Glaxo Wellcome公司上市, 其化学名为2′, 3′-双脱氧23硫代胞苷, 是一种胞嘧啶核苷类似物, 作为抗HIV药物早已获批准, 由于可明显抑制HBV的DNA复制, 后来其适应症扩大到慢性乙型肝炎。拉米夫定能抑制HBV的DNA多聚酶——逆转录酶, 使HBV的DNA降至下限, 转氨酶至正常, 对慢性乙型肝炎、失代偿性乙型肝炎导致的肝硬化、肝移植后乙型肝炎复发有预防治疗作用。2000年11月批准的片剂(每片100mg)与抗HIV感染的片剂(每片150mg)不同, 100mg/d可能是最佳的治疗剂量。耐受性良好, 口服给药不良反应的发生率很低, 以恶心、呕吐、腹泻及疲劳等较常见。但停药易复发, 需长期服用, 且有耐药病毒株出现。拉米夫定是第一个口服有效的乙型肝炎治疗药物, 主要用于干扰素无效的患者。
喷昔洛韦(penciclovir)及其前药泛昔洛韦(famciclovir)亦有抗肝炎病毒的作用, 泛昔洛韦口服后迅速吸收并转化为具有抗病毒活性的代谢物喷昔洛韦, 喷昔洛韦可抑制HBV DNA多聚酶活性, 对肝炎病毒DNA有强大的抑制作用。目前推行的“鸡尾酒”疗法, 将半量的拉米夫定、泛昔洛韦再配合胸腺肽治疗乙型肝炎。
SK1899也是喷昔洛韦的一种口服前药，具有良好的吸收性能，在体内迅速代谢为主要产物喷昔洛韦。
阿特福韦(adefovir)由Gilead Sciences公司开发, Ⅲ期临床研究证明有抗HBV活性(包括拉米夫定耐药性慢性HBV), 但口服生物利用度低, 过敏反应严重。阿特福韦二吡呋酯(adefovir dipivoxil, GS2840) 是阿特福韦的衍生物, 生物利用度高于阿特福韦, 在体内迅速转化为阿特福韦, 具有广谱抗病毒活性, 据查作为治疗拉米夫定耐药性慢性乙型肝炎的一线药已经上市。
另外,Bristol/Myers Squibb公司开发的entecavir(BMS-200475) 口服吸收良好, 体外实验表明有抗HBV活性, 不良反应轻微, 耐受性良好, 处于Ⅱ、Ⅲ期临床研究。Abott公司的emitricitabine的抗HBV活性表现在与干扰素α-nl、α-2a、α-2b 联用可产生协同作用, 不良反应小, 抗HBV 感染处于Ⅱ、Ⅲ期临床研究。
1. 2 生物类药物
干扰素(INF) 是FDA批准的第一个抗肝炎病毒药, 干扰素有3种(α,β，γ), 分别由人体白细胞、纤维母细胞及致敏淋巴细胞产生, 血原性干扰素已经不再使用, 目前使用基因工程制得的干扰素。α干扰素是国际公认的治疗慢性肝炎的抗病毒药, 干扰素α-2a(商品名Intron A)、干扰素α-2b(商品名Viraferon)由Schering-Plough 公司开发治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎。干扰素alfacon-1(商品名Infergen)由Yamanouchi公司开发, 获欧盟许可用于治疗丙型肝炎。但这类药物给药后在体内迅速达峰浓度, 并快速下降, 总有效率不超过40%。α干扰素注射剂(INFA22b, Schering-Plough公司开发)和利巴韦林口服剂(Schering-Plough 公司开发, 商品名Rebetol)的联用治疗以前从未治疗过或治疗后复发的丙型肝炎, 目前其复合制剂(商品名Rebetron)已上市。美国Enzon/Schering-Plough公司开发的聚乙二醇修饰的α22b 干扰素( 商品名Pegintron,Viraferonpeg), 聚乙二醇附着物呈长毛状, 它围绕干扰素使其避开人体的代谢系统, 使干扰素代谢延长以达较长的半衰期, 已经在欧美作为单一疗法得到认可。Pregenics公司附着聚乙二醇的干扰素α22a (商品名Pegasys)与Pegintron的代谢途径不一样, 但两者与利巴韦林联用的效果类似。
1. 3 免疫调节药
胸腺素( thymo sin) 是人工合成的28 肽化合物, 为胸腺肽第5 组分, 能促进T 细胞成熟, 使细胞在被各种抗原或有丝裂原激活后产生各种淋巴因子, 如α、γ干扰素, IL-2等, 促进抗体形成并抑制干细胞凋亡。大剂量时能对抗严重肝脏疾病。
Science Pharmaceuticals 公司开发的thymalfasin用于治疗乙型肝炎, 加强免疫系统, 作为单一疗法或与泛昔洛韦或拉米夫定联用治疗乙型肝炎, 而与α干扰素联用治疗丙型肝炎。IL-2能使细胞毒性T细胞增殖, 促进对感染的肝细胞的清除, 可增强乙型肝炎病毒表面抗原阳性患者的免疫力, 但长期抑制HBV的能力有待进一步证实。已上市。此外, 基因工程乙型肝炎疫苗(Bio-Hep-作为免疫刺激剂于2000 年在美国上市。
1. 4 乙肝疫苗
乙肝疫苗的发展为预防和治疗乙肝起到了巨大的作用。从传统的血源疫苗发展到重组乙肝疫苗,目前乙肝疫苗已发展到第三代的DNA 疫苗。
1．5 葡萄糖苷酶抑制剂衍生物
最近，有两种新的葡萄糖苷酶抑制剂衍生物N－壬基－脱氧野尻霉素（DNJ）和N－壬基－脱氧半乳糖野尻霉素（DGJ）问世。在葡萄糖苷酶抑制剂N－壬基－DGJ的作用下，病毒糖蛋白可发生错误折叠， 减少HBV的释放。在实验浓度下，N－壬基－DNJ和N－壬基－DGJ能够使HBV的DNA合成分别减少8/9和14/15。它们的抗病毒活性次于拉米夫定，但与其它核苷酸类似物相当。该药可能是通过干扰前基因组RNA衣壳的形成，加速病毒核心颗粒的降解，影响前基因组RNA逆转录酶而发挥治疗作用。此外，两者还可抑制病毒蛋白的合成，导致核蛋白错误装配。因此，它们弥补了核苷酸类似物作用的不足，而且没有后者的缺陷，如干扰核酸合成、线粒体毒性等不良作用。美国Jefferson医学院生化和分子药理系的Mehta等研究了亚氨基糖抑制剂抗HBV病毒的机制后发现，亚氨基糖可阻断HBV释放，但不会抑制连接N端的糖加工过程。虽然N－壬基－DNJ是内质网葡萄糖苷酶的抑制剂，但它在对内质网葡萄糖苷酶功能无影响的浓度下仍能保持抗病毒活性。该实验证实了以下假说：N－壬基－DNJ在不影响糖加工过程的情况下，仍能保持抗HBV活性。同时，有资料提示，N－壬基－DNJ在病毒包膜形成之前，可阻止HBV前基因组RNA的衣壳形成。
1．7 中草药有效成分及单味中草药
1．7．1 甘草甜素
日本研究较早，其制剂强力新甘草甜素注射液对病毒性肝炎患者有减轻症状、抗炎和降低转氨酶等作用。强力新的换代产品甘利欣为甘草酸二铵左旋化合物,疗效强于强力新。
1．7．2 甲基斑蝥胺
周国平等用2.2.15 细胞株体外抗HBV 模型,应用固相放射免疫测定法检测甲基斑蝥胺对2.2.15 细胞所分泌的HBsAg ,HBeAg 的抑制效果,应用Southern 转膜杂交法分析药物对HBV DNA区带的影响,同时以溴化四唑蓝(MTT) 法检测药物细胞毒性。药物对病毒复制指标HBsAg ,HBeAg 的50%抑制浓度(ID50)分别为2.83,4.60g·L?1 ,该药对HBV DNA区带无明显影响,药物对细胞的50 %毒性浓度(CD50 )为10.60g·L-1。药物对HBsAg ,HBeAg 的治疗指数(TI) = CD50/ID50分别为3.75, 2.30,说明甲基斑蝥胺药物在体外具有一定抗HBV活性。
1．7．3 柯天虎报道自中药猪苓中提取的猪苓多糖制成注射液, 临床证明有促进肝细胞再生及促进机体提前产生抗HBs 抗体和增加滴度的作用。已发现具有抗HBV活性、提高机体细胞免疫功能和减轻对肝细胞的破坏的中草药有效成分还有苦参素、香菇多糖、冬虫夏草多糖等。
1．7．4 具有抗HBV 活性的中草药很多,主要有叶下珠、白花蛇舌草、夏枯草、淡竹叶、女贞子、赤芍、丹皮和水芹等。这类药物不良反应相对较小,可长期服用。文立民等以HBV DNA 转染2. 2. 15 细胞株培养上清液中HBsAg 和HBeAg滴度作为天然药物抗HBV 效果的评价指标,对板蓝根、苦味叶下珠和4 种中药混合物的抗HBV 作用进行了比较。同时,应用MTT法检测药物的细胞毒性。结果显示,苦味叶下珠与4 种中药的混合物抗HBV 的作用较强,可望成为有潜力的抗HBV 药物。经临床实践和动物实验初步验证,不少清热利湿解毒中药对HBV有较强的抑制作用,体外抑制HBsAg作用明显且重复性较好的中药有大黄、黄柏、贯众、虎杖、山楂、败酱草、山豆根、石榴皮、肉桂等。李文等采用DNA 探针技术在100 种中草药研究中发现26 种对纯化了的HBV DNA 有不同程度的抑制作用,其中贯众、佩兰、荔枝核、珍珠菜、黄柏、茯苓、大黄、丹参、大活血和犁头草为高效药。
1、8 目前国外抗HBV药物的开发情况
预计2003～2005年可能批准上市的治疗乙型肝炎的品种有：emtricitabine和enticavir；以及治疗慢性乙型和丙型肝炎的免疫调节剂BAM-205。
Coviracil(emtricitabine)为Triangle制药公司开发的核苷类似物，据I～II期临床试验结果显示，该药能降低慢性感染病人的乙肝病毒水平。这项为期24周的双盲、剂量范围研究发现，分别接受Coviracil 200mg、100mg和25mg每天一次的病人中有61%、24%和22%的病毒DNA水平低于测定限(4700拷贝/ml)，该产品的耐受性较好。
经II～III期临床试验因疗效欠佳或不良反应较大而停止试验的抗乙肝病毒药有泛昔洛韦(famciclovir)。抗疱疹病毒药泛昔洛韦扩大适应症治疗慢性乙型肝炎，但此药单用于治疗乙型肝炎疗效不佳，易产生耐药病毒株，停药后反跳率高，国外已停止开发。其他还有洛布卡韦(lobucavir) 、非西他滨(fiacitabine )和非阿尿苷(fialuridine)等。
Interferon Sci公司的α-N3干扰素因临床试验对丙型肝炎无明显疗效，也已停止开发。
1、9 国内开发情况：
(1) 正在申报临床试验的品种有：治疗乙型肝炎的免疫调节剂丙帕锗及其胶囊、抗肝炎病毒新药阿德福韦酯，外资企业在中国申请新药临床试验的抗乙肝病毒恩替卡韦(enticavir )片剂及阿德福韦酯的衍生物LY-582563/MCC-478等。
(2) 已批准临床试验的品种有：抗疱疹病毒药泛昔洛韦扩大适应症治疗慢性乙型肝炎，但此药单用于治疗乙型肝炎疗效不佳，易产生耐药病毒株，停药后反跳率高，国外已停止开发。
(3) 已批准生产的品种有：我国研制的利巴韦林于1980年投产，批准用于临床治疗病毒性疾病的时间比美国FDA批准的早6年，所开发的口服新制剂有6个品种13个规格，2001年原料药的产量超过360吨，而各种亚型的α-干扰素及基因工程α-干扰素均能生产，今后应重视扩大适应症的研究，以便用于治疗慢性丙型肝炎。
(4) 我国1999年7月～2002年12月批准进口的抗肝炎病毒药新药有：拉米夫定片及口服液(贺普丁，Heptsdine，英国葛兰素史克研发生产)。而至2002年底在我国获得药品行政保护的品种有：拉米夫定及其片剂和口服液(1999年4月10日授权)；治疗丙型肝炎的复合干扰素干复津(infergen)针剂(2000年4月28日授权)。
2、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)药
人类免疫缺陷病毒(HIV )又称为艾滋病病毒。1981 年夏天人类发现了艾滋病和HIV , 抗HIV 药相继出现，目前临床所使用的药物主要针对病毒的2种酶——逆转录酶和蛋白酶发挥作用。但抗HIV药不能清除HIV，合用可降低病毒的复制，提高肌体的免疫现状，延长患者的生命。
2. 1 逆转录酶抑制剂
2. 1. 1 核苷类逆转录酶抑制剂 逆转录酶是HIV从mRNA逆转录为DNA过程中起主要作用的酶，逆转录酶抑制剂可作为逆转录酶的底物或竞争性抑制剂而阻止病毒的复制。核苷类似物为最早发现的逆转录酶抑制剂, 用于治疗艾滋病及其相关综合征, 减少机会性感染, 可降低死亡率但不能治愈，且不良反应严重。该类药物主要是在细胞内磷酸化形成5′-三磷酸的活性代谢产物, 与5′-三磷酸核苷竞争, 通过逆转录酶整合入病毒DNA ,引发病毒RNA 链提前终止, 从而抑制HIV的复制。所有的核苷类逆转录酶抑制剂都能引起一些罕见的但潜在的肝脏脂肪变性和致死性酸中毒综合征, 目前上市的主要有齐多夫定(zindovudine )、地丹诺辛(didanosine)、扎西他宾(zalcitabine)、司他夫定(stavudine)、拉米夫定(lamivudine), 阿巴卡韦(abacavir) , 另外齐多夫定(300mg)与拉米夫定(150mg)的复方片剂(商品名Combivir)已上市。
齐多夫定作为第一个用于治疗HIV感染的药物,除了抗成人HIV感染外, 在防止HIV传播方面, 能降低母婴传播的机率, 但可导致贫血及嗜中性粒细胞减少。地丹诺辛与齐多夫定作用相似, 主要与齐多夫定合用, 其新缓释胶囊剂(商品名Videx EC)的肠溶性小球保护活性物质不易降解, 使肠胃不良反应减轻。扎西他宾因为有严重的药物蓄积毒性且疗效差,很少应用。司他夫定近期主要用于三联疗法, 不可与齐多夫定、地丹诺辛合用。拉米夫定不良反应少, 主要与其他逆转录酶抑制剂联用治疗进行性HIV感染, 且和齐多夫定联用能预防H IV 的母婴垂直传播。阿巴卡韦口服生物利用度较高, 可单独用药或与其他逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂联用治疗HIV感染, 与拉米夫定效果相似, 经常用于初始治疗, 但可引起高血压。
Abott公司研制的emitricitabine是一种高效的HIV和乙型肝炎病毒(HBV)选择性抑制剂, 在抗HIV感染方面, 与齐多夫定联用有协同作用, 处于Ⅲ期临床研究阶段。
美国Gilead公司研制的tenofovir DF是杂环碱基腺嘌呤的N-2-(22-膦酰基甲氧基丙基)生物活性对映体teneofovir (R-PMPA)的衍生物, 有选择性抗HIV和其他逆转录病毒的强活性, 口服生物利用度比teneofovir高, 活性增强4～5倍, 用于HIV感染患者的初次和辅助治疗, 目前已上市。
2. 1. 2 非核苷类逆转录酶抑制剂
非核苷类逆转录酶抑制剂亦能抑制逆转录酶, 但作用机制与核苷类逆转录酶抑制剂不同, 已经上市品种主要有奈韦拉平(nevirap ine)、地拉韦定(delavirdine)、efavirenz等, 这类药物相互间的交叉耐药很普遍, 可引起皮疹。奈韦拉平对核苷类敏感性或耐药性病毒均有效,其新软凝胶剂已上市, 能降低HIV 母婴间传播, 且用药只须每日1次(产妇在分娩时和婴儿出生数天), 比其他疗法简便易行, 又大大节省了费用, 但该药可引起史蒂文斯-约翰逊综合征。efavirenz 口服有效, 每日1次的片剂(商品名Sustiva)作为一线用药正等待批准。日本三菱化学公司与美国Triangle公司及Abbott公司联合开发的emivirine具有体外抗HIV活性, 与其他逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂联用降低病毒携载量, 不易产生耐药性, 作为蛋白酶抑制剂辅助疗法的初始治疗有好处。SJ-3366是一种新的非核苷类逆转录酶抑制剂, 与其他非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂有协同作用, 抗HIV感染的机制有多种, 为临床治疗HIV感染提供了一种新的化合物。
2. 2 HIV 蛋白酶抑制剂
HIV蛋白酶抑制剂通过抑制蛋白酶对Gag和Gag- Pol蛋白的水解过程, 从而干扰病毒的成熟过程, 继而使感染细胞释放出未成熟的不具传染性的病毒粒子, 达到抑制病毒复制的目的。已上市的代表药物有沙奎那韦(saquinavir), 利托那韦(ritonavir), 茚地纳韦(indinavir), 奈非那韦(nelfinavir), amprenavir, lopinavir/利托那韦(商品名Kaletra)。蛋白酶抑制剂的研究开发为HIV患者增加了治疗方法的选择, 并使患者的寿命延长, 生活质量改善。但所用的蛋白酶抑制剂都能引起胃肠不适和转氨酶活性升高。
沙奎那韦是第一个抗HIV感染的蛋白酶抑制剂,与核苷类逆转录酶抑制剂联用治疗晚期HIV感染。目前其软胶囊(商品名Fortovase)已上市, 吸收良好, 生物利用度改善, 基本取代老剂型(甲磺酸沙奎那韦硬胶囊), 且沙奎那韦软胶囊1600mg/d与利托那韦100mg/d联用效果良好。利托那韦常用于与其他核苷类逆转录酶的三联疗法中, 也可用于儿童的HIV感染, 可降低病毒的携载量, 耐受性良好, 不良反应少, 其软胶囊(商品名Norvir)已上市。茚地那韦口服生物利用度较好, 与核苷类逆转录酶抑制剂联合用于HIV感染晚期或进行性免疫缺陷患者。奈非那韦可与食物同服, 是最常用的蛋白酶抑制剂, 与核苷类逆转录酶抑制剂联用治疗成人或儿童的HIV感染。amprenavir也能用于成人和儿童HIV感染, 其效果和影响尚待于进一步考察。Abbott公司上市的lopinavir/利托那韦复方制剂有胶囊和溶液2种剂型, 其中利托那韦抑制lopinavir在体内的代谢, 使lopinavir的血药浓度升高, 抗病毒效果加强, 与其他逆转录酶抑制剂联用治疗成人和6个月以上儿童HIV感染, 对于母婴垂直传播的预防正等待批准。 Boehringer Ingeleim 公司开发的tipranavir是第一个新型的非肽类HIV蛋白酶抑制剂, 能降低先前应用其他蛋白酶抑制剂失败的患者的病毒携载量, 升高CD4细胞数, 现已进入Ⅱ期临床研究。另外，atazanavir（BMS-232632）的Ⅰ期临床实验证明, 其抗HIV活性比临床应用的5种蛋白酶抑制剂强, 生物利用度良好, 对其他耐药病毒株所致的感染疗效好。已于2003年7月获FDA批准上市。fosamprenavir是amprenavir的磷酸酯, 极易溶于水,抗HIV 感染试验表明该药安全有效, 已于2003年10月20日获FDA批准上市。
2. 3 高活性抗逆转录病毒联合疗法
联合3种或4种药物(通常包含一种蛋白酶抑制剂) 的高活性抗逆转录病毒联合疗法(HAART ) 已成为护理治疗HIV感染的标准方法, 可以使HIV感染患者的死亡率和发病率明显减低, 药物之间的相互作用及合理搭配使HAART的效果比单一用药有优势。对成人HIV感染治疗效果好, 对于围生期H IV 感染儿童的存活率也有所提高。三联HIV治疗药物已有上市, 第一个含有3种抗HIV药物的产品(商品名Trizivir)每片含有逆转录酶抑制剂阿巴卡韦300mg、拉米夫定150mg、齐多夫定300mg, 使用与这3种组分相当的价格上市, 每日服用2次, 每次1片, 但不适于体重不足40.82kg的患者, 其中阿巴卡韦的不良反应(高血压)也限制了它的应用。新的艾滋病治疗指南改变了原先的推荐, 当无症状个体CD4 T细胞低于350/mm3(而不是低于500/mm3) 时开始治疗, 根据患者的病毒携载量(血浆中的HIV RNA水平)考察无症状个体接受治疗的标准: 用分支DNA试验, 病毒携载量>30000拷贝/ml(以前是10000拷贝/ml)；逆转录酶多聚酶链反应, 病毒携载量55000拷贝/ml(以前20000拷贝/ml)。虽然HAART效果良好, 但费用昂贵且HIV的耐药问题及HAART药物的毒性一直困扰着医药工作者, 因此他们致力于开发一些新的药物。
2. 4 抗HIV进入细胞的抑制剂
2003年3月，FDA批准了一种新作用机理的抗艾滋病新药Fuzeon(enfuvirtide)上市。由瑞士罗氏制药公司研发。20世纪80年代以来的抗艾滋病药物，都是在人体免疫系统的细胞内部起作用，阻止病毒在细胞内的复制。CD4位于T辅助细胞表面, 是HIV感染T淋巴细胞的受体, HIV糖蛋白gp120与CD4分子结合是HIV感染的第一个步骤。感染的HIV与CD4 T细胞表面的趋化因子受体CCR5或CXCR4结合, 然后与细胞膜融合而侵入细胞。科学家根据这一规律试图设计一些药物, 阻止HIV与受体结合或阻止其与细胞膜的融合, 则可中止感染, 达到杀病毒的目的。Enfuvirtide就属于这一机理，它被称为“融合抑制剂”，通过阻止病毒与白细胞等免疫细胞的接触融合来发生作用。因此，它对已经产生抗药性的艾滋病病毒变种更有效,是一种“更高级别的”抗艾滋病药物，对于那些服用其他药物作用不大的艾滋病患者，是一个延长生命的选择。该药通过不同的途径控制病毒传播，对已经产生抗药性的患者效果明显，它“为我们的抗艾滋病武器库增加了一个重要类别”。对药物的长期作用，还须在今后的临床应用中评估，特别是新药物可能引发肺炎等副作用值得关注。
此外还出现了几种细胞进入抑制剂, Trimeris公司开发的T-1249 的Ⅰ、Ⅱ期临床研究表明, 能降低病毒携载量, 且耐受性良好。Progenics公司研制的Pro-542和Pro-140作用于HIV进入细胞的不同环节, 而具有协同抗病毒作用, Pro-542 是一种细胞进入抑制剂, 竞争HIV结合位点CD4而成类似抗体分子, 阻止gp120与CD4结合,正处于Ⅱ期临床研究阶段; Pro-140抑制HIV与共同受体CCR5的结合, 正在做临床前研究。Bicy clam公司的AMD-3100通过键合在受体CXCR4上而具有强效抑制HIV-1和HIV-2复制的作用。
2. 5 免疫调节药
HIV感染的特征是免疫缺陷, HAART可以有效地抑制多数HIV感染的病毒复制, 延缓病程, 但不能清除病毒, 停药后仍可出现病毒反跳。免疫调节药则有助于对抗HIV的耐药性, 如白介素-2(IL-2)作为辅助用药, 可提高肌体的免疫活性, 长期使用安全性、耐受性良好, 可降低病毒的携载量, CD4细胞数上升, 有希望应用于临床。另外, Hollis-Eden公司开发的HE2000通过抑制宿主细胞病毒复制所需的能量产生酶起作用, 根据免疫学的变化, 服用HE2000能维持或改善HIV患者的免疫现状, 有助于推延或防止艾滋病的侵袭。此外, 预防HIV 感染的疫苗正在研制中。
3 抗巨细胞病毒药物
所有年龄段的人均可感染巨细胞病毒(CMV), 但只有免疫功能低下时(如艾滋病患者, 器官移植患者,癌症患者)才会导致疾病, 最常见的是CMV视网膜炎。
更昔洛韦(ganciclovir)是美国食品与药品管理局批准的第一个治疗CMV感染的药物, 也是首选药, 对CMV有较强的抑制作用, 但毒性大。动物实验有致畸作用且有贫血、神经毒性等不良反应, 所以仅限于治疗严重免疫功能低下并发的CMV 感染, 有效率可达70%～80%, 但不能治愈, 需维持治疗, 单用易产生耐药性, 故推荐联合用药方案。
更昔洛韦的前药valganciclovir在不改变更昔洛韦的安全性和有效性的情况下, 口服生物利用度提高, 目前已上市, 用于CMV视网膜炎的治疗。
Astra公司开发的膦甲酸(foscarnet)用于治疗艾滋病患者伴发的CMV视网膜炎和抗HIV治疗(与齐多夫定合用有协同作用)、更昔洛韦耐药性CMV全身感染, 有肾毒性, 口服生物利用度差, 故需静脉给药。
西多福韦(cidofovir) 是Gilead 公司开发的开环核苷类似物, 1996 年上市, 治疗艾滋病患者CMV视网膜炎, 存在不可逆性肾功能损害。静脉给药, 与膦甲酸、更昔洛韦、齐多夫定或阿昔洛韦合用有协同或加成作用。
福米韦生(formivirsen, vitrarene)由ISIS公司研制, 1998年在美国上市, 是世界上第一个被批准的反义寡核苷酸药物, CMV复制抑制剂, 用于治疗艾滋病患者CMV视网膜炎, 局部治疗新确诊的或对其他疗法无效或不适用的晚期CMV 视网膜炎, 2～4周内接受过西多福韦治疗的患者不应使用本品。福米韦生能显著延缓CMV视网膜炎的病情进展, 不良反应是眼内压升高, 轻至中度的可逆性眼内炎症。
Bayer公司开发新口服抑制病毒DNA的药物Bay-384766, 抗CMV活性与已上市药物相当或稍显优势, 正处于Ⅱ期临床研究中。
CMV抗体司韦单抗(Sevirum ab, protovir)能改善CMV感染患者骨髓抑制效果。
Glaxo Wellcome公司开发的Maribavir可通过锁定DNA的未端,抑制病毒DNA的合成，主要用于艾滋病患者CMV感染。仍处于临床研究。
4 抗疱疹病毒药物
疱疹病毒分为单纯疱疹(HSV)和水痘-带状疱疹(VZV), Ⅰ型HSV主要导致口唇疱疹, Ⅱ型HSV主要导致生殖器疱疹。目前抗疱疹病毒药物主要是核苷类药物, 这类化合物经过病毒胸苷激酶磷酸化成三磷酸化合物与三磷酸脱氧尿苷竞争, 从而抑制病毒DNA的合成。
Glaxo Wellcome公司开发的阿昔洛韦(aciclovir)是治疗疱疹病毒感染的首选药, 广泛用于治疗疱疹性角膜炎、生殖器疱疹、全身带状疱疹及疱疹性脑炎, 口服可加速组织病损的形成, 减少新病损部位, 但长期使用可出现耐药性。伐昔洛韦(valacilovir)是阿昔洛韦的前药, 即和L-缬氨酸的酯, 口服吸收后转化为阿昔洛韦, 能改善阿昔洛韦口服给药吸收不良的缺点, 生物利用度提高3～5倍, 用量少、起效快、毒性小, 可以提高患者的依从性。现已成功取代阿昔洛韦成为治疗带状疱疹和生殖疱疹的一线用药。肾功能障碍的患者在服用此两药时需调节剂量。
喷昔洛韦用于治疗成人口唇单纯疱疹可明显加快疼痛的消失, 软膏剂可外用。泛昔洛韦治疗急性带状疱疹, 毒性小, 与阿昔洛韦、伐昔洛韦相比, 起效快, 持续时间长。
二十二烷醇(n-docosanal)是美国Lidakol公司开发的由22个碳原子串联组成的饱和醇, 具有抗HSV活性, 通过抑制HSV包膜与细胞膜之间的融合, 抑制HSV感染。体外研究发现, 通过减少感染性病毒和病毒抗原的释放, 明显抑制HSV的复制。作为治疗口唇疱疹的外用药于2000年被美国批准, 已作为非处方药在市场销售。
洛布卡韦(lobucavir)已进行了水痘带状疱疹和HBV 感染的Ⅱ期临床评价, 口服生物利用度为20%, 局部用药效果良好, 不良反应少。但是用于HBV感染的开发已经停止。
5 抗流感病毒药物
目前已经知道的流感病毒有甲、乙、丙型, 流行的主要是甲型和乙型, 现在使用的主要有两类。
5. 1 M2抑制剂
金刚烷胺(amantadine) 和金刚乙胺(rimantadine)是在欧美等国一直以来就被认可的抗流行性感冒药, 主要是通过抑制A型病毒的M2蛋白的离子通道来抑制病毒复制。只对A型流感病毒有抑制作用且疗效相似(B型流感病毒不携带M2蛋白, 故无效)。轻症A型流感早期用药可降低热度, 缩短病程。该类药是使用方便的口服药, 但易产生耐药性, 同时也出现眩晕、失眠等不良反应。
5. 2 神经氨酸酶抑制剂
神经氨酸酶(唾液酸酶)是呼吸道病毒复制的关键酶, 能使唾液酸和细胞表面蛋白之间的化学键断裂, 从而使流感病毒从感染细胞中释放, 并在呼吸道播放。已经开发并用于临床的神经氨酸酶抑制剂有扎那米韦(zanamivir)与oseltamivir, 另外RWJ-27021也已进入临床实验阶段。
扎那米韦由澳大利亚Biota公司研制, 英国Glaxo Wellcome公司1999年在美国上市, 可选择性抑制流感病毒表面的神经氨酸酶, 抑制流感病毒A和B的复制。具有喷雾剂、雾化剂、干粉气溶剂等剂型, 口服无效。适用于流感出现不到2日的成年人和12 岁以上的青少年, 且越早使用越好。
oseltamivir由Gilead Sciences公司研制, 瑞士Hoffmann-la Roche公司于1999年10月上市, 为口服制剂, 治疗A、B型流感能缩短病程, 疗效与扎那米韦相似。现又被开发成为oseltamivir磷酸酯形式，并已成为治疗和预防A型和B型流感病毒的有效药物。
RWJ2270201(BCX21812)是由Biocryst公司近期合成的一种新型抗流感的神经氨酸酶抑制剂, 其活性与扎那米韦、oseltamivir相似或更强, 体外研究显示对流感病毒有极高的选择性, 2001 年在北美和欧洲开始了用于治疗流感的Ⅲ期临床研究, 旨在验证该药每日1次口服疗法的安全性和有效性。
神经氨酸酶抑制剂与M2抑制剂相比具有许多优点, 它们的抗病毒谱广, 耐药性少, 早期治疗可降低疾病的严重性及延续时间, 加速功能的恢复。
6 回顾与展望
到目前为止, 尚无令人完全满意的抗病毒药, 加紧研制高效、低毒、选择性高且价格便宜、实用方便的抗病毒药对广大医药工作者来说是一种挑战。
有人对1998年至2003年国内外上市的抗病毒类药物进行统计，结果如下：
１、国外批准上市的抗病毒药物
１９９８年１月～２００３年３月底，国外首次上市的抗病毒新药共１２个。
（１）抗疱疹病毒药３种，占２５．０％：
福米韦生（farmivisin，美国ISIS公司，1998），反义寡核苷酸，眼内植埋给药，治疗ＣＭＶ急性视网膜炎；多可沙诺（docosanol，美国avanir／史克必成，2000），局部给药，治疗口、脸部疱疹；缬昔洛韦（valganciclovir，罗氏，2001），更昔洛韦的前药，治疗免疫功能缺陷患者ＣＭＶ感染引起的急性视网膜炎。
（２）抗流感病毒药２种，占16.7％：
扎那米韦（zanamivir，葛兰素威康，1999），流感病毒神经氨酸酶抑制剂；奥司米韦（oseltamivir，罗氏，1999），流感病毒神经氨酸酶抑制剂。
（３）抗人免疫缺陷病毒（HIV）６种，占50.0%：
依非韦伦（efavirenz，美国Dupont，1998）， HIV非核苷类逆转录酶抑制剂；阿巴卡韦（abacavir，葛兰素威康，1998）， HIV核苷类逆转录酶抑制剂；安泼那韦（amprenavir，葛兰素威康，1999）， HIV蛋白酶抑制剂；洛匹那韦（lopinavir，美国雅培，2000）， HIV蛋白酶抑制剂，与利托那韦组成复方制剂，商品名kaleta；替诺福韦酯（tinofovir disoproxil, 美国Gilead, 2001）， HIV核苷酸类逆转录酶抑制剂；恩夫韦地（enfuvirtide、T-20，罗氏，2003）， HIV融合抑制剂。
（４）广谱抗病毒药１种，占8.3%：
阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，美国Gilead,2000），HIV核苷类逆转录酶抑制剂；FDA批准用于治疗慢性乙型肝炎。
２、1998-2002年国外开发的抗病毒药新制剂
（１）去羟肌苷分散片（1998）和肠溶缓释胶囊（2000）；
（２）利托那韦软胶囊（雅培，1999），改善口服生物利用度；
（３）trivizir含有阿巴卡韦300ｍｇ、拉米夫定150ｍｇ和齐多夫定300ｍｇ的复方制剂（葛兰素史克，2000）；
（４）司他夫定缓释片100ｍｇ（百时美施贵宝，2002） ，一日给药一次；
（５）依非韦伦口服液及胶囊（默克，2002）。
３、国外统计年报未作为新药统计的新活性物
（１）干扰素复合物（pegintron，先灵葆雅，2000），重组基因干扰素α-2b的聚乙二醇复合物，与利巴韦林合用治疗慢性丙型肝炎。
（２）干扰素复合物（pegasys，罗氏，2001），干扰素α-2b的聚乙二醇复合物，单用或与利巴韦林合用治疗慢性丙型肝炎。
４、新上市的生物制品
1998-2002年有18种预防病毒感染的疫苗、免疫球蛋白、单克隆抗体等生物制剂首次上市，如基因工程甲型、乙型肝炎疫苗和甲、乙型混合疫苗，水痘－带状疱疹疫苗、预防旅行者及婴幼儿腹泻的轮状病毒疫苗、乙型肝炎免疫球蛋白、巨细胞病毒免疫球蛋白和合胞病毒单克隆抗体等。
目前，国外抗病毒新药研发的主要发展方向有以下几个方面：
１、利用病毒复制过程中病毒基因组所需的关键性酶，如HIV逆转录酶、蛋白合成酶和整合酶作为靶点筛选新药。
2、开发反义寡核苷酸药物，对病毒基因组某一片段进行核苷酸测序，然后合成其对应的反义寡核苷酸，可用于抑制病毒的复制。
3、寻找和发现病毒新受体，合成其抑制剂，可干扰病毒颗粒与受体细胞的融合及穿透细胞膜侵入宿主细胞。
4、以病毒颗粒的表面抗原为靶点，合成新的抑制剂。
5、采用构效分析设计新化合物，再用组合化学制备一系列衍生物，最后选定特异性酶进行高通量的筛选。
我国研发单位对抗病毒新药的研究与开发，可采用以下的方法和手段：
１、选择疗效好、不良反应较小未在中国申请专利的产品进行抢仿，尽管我国已加入世界贸易组织，但在今后的一段时间内，仿制非专利药仍将是我国医药产业的主流。
２、仿制行政保护期即将期满或未在中国申请专利，但已获得中国进口药品注册证的产品，如抗ＨＩＶ药物齐多夫定、司他夫定、去羟肌苷、依非韦伦、茚地那韦、沙喹那韦和利托那韦等。按新修订的《药品注册管理办法》，此类药物均可采取简易申请的办法，药效和毒理试验可用文献资料替代，这样可减少研制的难度。
３、利用已批准的新药开发新剂型，如我国自行研制的利巴韦林新剂型有９种，阿昔洛韦有６种，均为国外未批准上市的新剂型。如技术含量高，有独创性的新制剂也可申请专利。
４、开展合成工艺研究，开发有独立知识产权的生产、制备方法，以降低成本，减少“三废”，利于扩大生产，争取出口创汇，如利巴韦林双酶法制备工艺和更昔洛韦合成新工艺等均已申请中国专利。
５、对国外已报道有活性的新结构化合物，进行结构修饰，或制备新的衍生物和前体药物，以改善理化性能或提高口服生物利用度，如阿昔洛韦和更昔洛韦的缬氨酸酯，齐多夫定的５＇－磷酸酯等。（[url]www.sDrug.com[/url]） 目前，治疗乙肝新药不断推出，但尚无特效者，根治乙肝尚难以实现。根据权威的诊疗标准，现治疗慢性乙肝所能获得的最佳疗效为显效，而无彻底治愈之说。显效指肝功复常，乙肝病毒指标(乙肝病毒脱氧核糖核酸、乙肝病毒e抗原、乙肝病毒表面抗原等)悉数转阴，并能保持1年以上时间。但达到此目标并非易事，必须做到科学、合理用药。 治疗乙肝虽无特效药物，却不乏有效药物。合理配伍应用有效药物，可以减轻乙肝炎症反应，抑制乙肝病毒复制，阻止肝纤维化加剧，抗乙肝病毒主要有于扰素及核苷类抗病毒药物拉米芙定等，这些药物为治疗乙肝的主攻药物，但疗效不稳定或有效率低，选用时定要严格审查，只有符合其用药适应证的患者才能应用，胸腺肽类药物单独应用很难判断其有效性，如与上述药物联合应用效果可能会好一点，但是缺乏足够的临床证据。在抗病毒治疗的时候可以辅助应用抗纤维化的药物是不是效果更好一点呢？
不知对不对，请指教！ 干扰素抗病毒治疗不仅有抗病毒作用,还有抗纤维化作用,延缓或减少肝癌的发生,一般认为联合胸腺肽类药物有协助作用.一般干扰素无效,可用长效干扰素.一般认为α干扰素和拉米夫定治疗显效的近期均不能清除细胞内HBV cccDNA,停药后部分病例容易复发.
抗病毒药物的联合使用：现有抗病毒药物各自的缺点，长期单用一种药物治疗难度较大。可有两种方法：一是联合多种药物治疗，以增强疗效，缩短疗程，但目前没有行之有效的药物组合，包括干扰素与拉米夫定的联合已被认为不能增加疗效。二是多种药物的序贯治疗，以达到长期治疗的目的。如干扰素与核苷类药物的序贯治疗、几种核苷类药物的序贯治疗(如拉米夫定与阿德福韦)等，已被证明有比单用任一种药物更好的疗效。核苷类药物的序贯治疗应当是先用一种药物治疗，如未发生耐药突变，则继续用药，如发生了耐药突变，则更换为另一种核苷类药物，从而完成长达数年的长期治疗。两种或多种核苷类药物同时使用可减少病毒的耐药突变，但价格昂贵，且疗效增加不多，不符合药品经济学的原则。
目前抗病毒药物都是外国人搞的,价格较贵,国产的一些药也有一些抗病毒作用,虽效果差些,但可试用,如乙肝健AB片,双环醇,中草药
HBV携带者的抗病毒治疗更困难, 先发两篇资料
北京大学第一医院 斯崇文教授在中华医学会第七次感染病会议的讲课内容
慢性乙型肝炎抗病毒治疗的进展?
根据WHO的估计，全世界乙型肝炎病毒(HBV)携带者约3.5亿人。根据国内1992～1994年全国血清流行病学调查，HBsAg携带率达9.75%，推算约1亿2千万人。慢性乙型肝炎病人为3000万，其中10%～20%可发展为肝硬化，1%～5%可演变为肝癌。HBV携带者的母亲可以通过垂直传播给婴儿，婴儿时期感染HBV者，90%以上受染成为慢性HBsAg携带者，影响下一代的健康成长，危害极大。?
目前慢性乙型肝炎的治疗，采用抗病毒、免疫调节、改善肝功能和抗肝纤维化等综合治疗， 但抗病毒治疗是其中最主要的治疗措
施。HBV虽无超接致肝细胞病变的作用，但可诱发人体的免疫应答使肝细胞发生免疫病理，引起炎症、坏死和纤维化病变。大量的临床研究证明，HBV在体内持续复制，可引起肝脏病变的持续活动和发展，甚至演变为肝硬化、重型肝炎和肝癌。我们在临床工作中亦可以观察到，慢性乙型肝炎病人仅有肝功能如ALT的好转或恢复正常，而HBV并未消除，此类病人极易复发，而且不能阻止肝脏病变的发展。因此，用抗病毒治疗来清除HBV是根本的治疗措施。抗HBV药物有干扰素、核苷类似物(nucleoside analogues)和免疫调节剂。
一、慢性乙型肝炎的抗病毒治疗 ?
(一)干扰素(Interferons)?
干扰素有α、β、γ一种，分别由白细胞、成纤维细胞和免疫淋巴细胞产生。具有抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节活性。用于病毒性肝炎治疗的主要是干扰α素。是目前国内、外公认治病毒性肝炎有效的药物。干扰素的抗病毒作用主要是通过干扰素与细胞膜上的干扰素受体结合，诱生多种抗病毒蛋白如2′5′寡腺苷酸合成酶(2′5′AS)、MX蛋白、蛋白激酶、磷酸二酯酶等，可以阻碍病毒核酸及蛋白的合成，抑制病毒复制。干扰素的免疫调节作用是通过增强细胞膜上HLA的表达，使细胞毒性T淋巴细胞(CTL)易于识别和杀伤HBV感染的靶细胞。亦能增强免疫活性细胞如NK细胞、CTL、K细胞和巨噬细胞等的免疫活性，可以杀伤肝炎病毒感染靶细胞，使HBV得取消除。?
干扰素α治疗慢性乙型肝炎的疗效与治疗剂量及疗程有关。治疗结束后即刻(近期)疗效(HBV DNA及HBeAg阴转)为30%～50%。而停药后1年(远期)疗效，约为20～40%。HBsAg阴转率较低，一般在10%以下。因此，干扰素α治疗慢性乙肝，只是抑制HBV复制，而不是清除HBV。女性病人、肝脏病变明显活动(ALT明显升高，肝脏炎症、坏死病变明显者)疗效好。血清HBV DNA水平高(＞200pg/ml)、母婴传播者、变异病毒株感染、合并其它病毒(如HIV、HCV、HDV等)感染者，疗效差。近年来，有PEG(Polyethylenc glycol，聚乙二醇)干扰素(PEG interferon)和组合干扰素(Consensus interferon,CIFN)，二种新的干扰素制剂应用于临床。PEG干扰素是大分子PEG与干扰素α连接，干扰素由肾脏的排泄时间减慢，血液干扰素的半衰期明显延长，可达48～72hrs。同时，由于随着PEG的降解，使干扰素逐渐释放，维持血中干扰素恒定的有效浓度可达168hrs。达到"长效"的目的，因而又称"长效干扰素"。国外主要用于治疗慢性丙肝，临床试验结果证明，持久有效(停药6个月后，继续保持HCV RNA阴转和ALT复常)率可达30%～40%，疗效优于一般干扰素α7，而不良反应相似。美国FDA已正式批准用于治疗慢性丙肝。目前在国外上市的PEG干扰素有PEG干扰素α2a(pegasys)和PEG干扰素α2b(PEG Intron A)一种。治疗慢性乙肝的临床试验正在国内、外进行中。?
组合干扰素为11个干扰素α亚型的基因序列，用基因工程方法组合而成。主要用于治疗慢性丙型肝炎。临床治疗结果证明，CIFN15ug组的疗效优于干扰素α2a 3MU组。而9ug组疗效与干扰素α2a 3MU组相似。不良反应：CIFN 15ug组稍高，9ug组与干扰素α2a 3MU组相似。?
(二)核苷类似物(nucleoside analogues)?
核苷类似物是近年来抗病毒药物研究的热点，进展很快。核苷类似物主要通过病毒产生的胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinc kinase)，使之磷酶化成为三磷酸核苷类似物，可以抑制病毒的DNA多聚酶和逆转录酶的活性；并与核苷酸竞争性掺入病毒的DNA链，终止DNA链的延长和合成，使病毒的复制受到抑制而发挥抗病毒作用。用于治疗慢性乙肝的核苷类似物主要有以下几种：?
1?阿糖腺苷(Adenine arabinoside;Ara-A)和单磷酸阿糖腺苷(Ara-Amp)?
Ara-A用于治疗慢性乙型肝炎，对HBeAg和HBV DNA的阴转率为30%～40%。根据国内研究，与胸腺肽或乙肝疫苗合用可以提高疗效。?Ara-A的水溶性低，只能稀释后供静脉脉滴注。而Ara-Amp的水溶性高，较Ara-A大400倍，除供静脉滴注外，可供肌肉注射。目前Ara-ALT已淘汰不用，均采用Ara-Amp治疗。剂量为200mg每日2次。(体重≤60kg者，前10天剂量为200mg，每日2次，以后改为200mg，每日1次)。肌肉注射或静脉滴注。疗程为30日。治疗有效者可间隔半个月后，再重复1个疗程。不良反应为可有食欲减退，恶心、呕吐腹泻等胃肠道反应。偶可引起白细胞及血小板降低，最严重反应肢痛症，是该药引起的神经肌肉毒性，一般应用上述剂量很少发生。但在治疗过程中须密切观察。?
2?拉咪呋啶(Lamivudine，二脱氧硫代胞苷，3TC)?
Lamivudine是近年来新合成的二脱氧胞嘧啶核苷类似物。最早用于治疗AIDS。以后发现对HBV和HIV混合感染病人，有明显的抗HBV作用。在动物实验中，对鸭乙肝病毒(DHBV)和黑猩猩感染HBV均有很强的抑制作用。?
近年来对Lamivudine治疗慢性乙型肝炎作了大量的临床研究。治疗1年的临床试验结果；口服Lamivudin 100mg/d，于服药2～4周后，血清HBV DNA水平明显下降，HBV DNA阴转率可达90%。1年时，HBV DNA持续阳转率为80%。ALT持续复常率为60%。但HBeAg阴转率约为20%～25%。HBeAg血清转换(血清HBeAg阴转，抗HBe阳转)率为15%～20%。治疗1年时肝活检复查，肝脏炎症坏死病变明显改善，肝纤维化程度亦有减轻。但过早停药，多数病人出现复发。目前认为出现HBeAg血清转换后，常可获得持久疗效，停用Lamivudine后常不出现复发。可以作为拉米夫定停药的指征。建议在拉米夫定治疗至病人出现HBeAg血清转换，继续用药6个月后复查，仍保持HBeAg血清转换者可以停药，停药后继续观察1年。临床研究发现，病人治疗前血清ALT升高程度与HBeAg血清转换率密切相关。病人治疗前血清ALT愈高(ALT≥2～5倍正常值上限)，拉咪呋啶治疗的效果愈好。因止，拉米夫定治疗的指征，应选择治疗前血清ALT升高的慢性乙肝病人。?长期(一般在6个月以上)应用Lamivudine治疗后，HBV DNA多聚酶C区可出现YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、门冬氨酸、门冬氨酸)的变异，YMDD变异共分2型；1型YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)第741个核苷酸部位，A→G置换，因而，使HBV DNA多聚酶C区YMDD分子中，第552个密码子蛋氨酸被缬氨酸取代，成为YVDD变异。Ⅱ型YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G→T置换，使HBV DNA多聚酶C区YMDD分子中，第552个密码子蛋氨酸被异亮氨酸取代，成为YIDD变异。YVDD和YIDD变异均可伴有P区基因669个核苷酸T→A的置换，使HBV DNA多聚酶B区528个密码子亮氨酸被蛋氨酸取代，成为L528M变异，但与YVDD合并变异较常见。YMDD变异株的复制能力低于野生株。因此，一般血清中HBV DNA水平较低，但停止治疗后，野生株可重新替代变异株。当发生YMDD变异时，可引起对拉米夫定的耐药，HBV又重新复制，病人病情可以复发。但多数病人仅有HBV DNA重新转阳和ALT重新升高，一般均低于治疗前水平。继续用Lamivudine治疗仍能有效，可出现血清HBeAg血清转换，肝组织象亦有改善，但须密切观察。当病人血清≥5倍正常值上限，并出现食欲不振、恶心、呕吐等肝炎症状加重时，或发生黄疸或肝功能失代偿改变时，应及时停药，积极应用保肝治疗并密切观察病情变化。Lamivudine治疗不良反应很轻，与安慰剂组无明显差别。无心、脑、肝、肾等重要脏器毒性和骨髓抑制、亦无血清胰酶和肌酶升高的现象。?
3?泛昔洛韦(fam ciclovir)?
为鸟嘌呤核苷类似物。是潘昔洛韦的前体药，可用作口服。泛昔洛韦口服后吸收良好，在体内迅速转化为潘昔洛韦，在细胞内磷酸化为二磷酸潘昔洛韦，具有抗病毒活性，可以抑制HBV的DNA多聚酶，阻止病毒的复制。?
根据国外一组多中心随机对照研究，泛昔洛韦125～500mg,每日3次，疗程16周。治疗结束后，HBV DNA阴转率为70%，并有ALT恢复正常。HBeAg阴转率亦较低。但停药后血清HBV DNA又恢复至治疗前水平。但亦有人报道，泛昔洛韦抗HBV作用较拉米夫定弱。香港的一组报道，应用拉米夫定和泛昔洛韦治疗慢性乙型肝炎的疗效对比研究，在治疗12周末，拉米夫定治疗组HBV DNA阴转率78%，而泛昔洛韦组仅为8%。长期应用泛昔洛韦治疗亦可发生HBV变异。在HBV DNA多聚酶B区第528密码子亮氨酸(L)为蛋氨酸(M)取代，成为L528M。在应用拉米夫定治疗时，亦可有相同的变异。因此，泛昔洛韦治疗发生L528M变异时，可发生与拉米夫定发生交叉耐药。其它尚有V521L、P525L等的多点变异。由于泛昔洛韦抗HBV作用弱，而且治疗后亦可发生病毒变异。因此，目前主张与其它抗HBV药物和免疫调节剂联合治疗。一般剂量为500mg，每日3次。?
不良反应亦很轻，发生率亦不高。可有头痛、恶心和腹泻等，但与安慰剂相似。此外，有皮疹如荨麻疹、幻觉等精神症状。少数病人有中性粒细胞减少和ALT升高。?
4?阿地福韦(adefovir)?
为嘌呤类核苷类似物。阿地福韦双酯(adefovir dipivoxil)为阿地福韦前体药，可以口服。口服后可迅速水解为阿地福韦。不须要磷酸化即有抗病毒作用。能抑制HBV DNA多聚酶的活性；并能掺入病毒的DNA中，终止病毒DNA链的延长，抑制病毒的复制。对拉米大定和泛昔洛韦耐药的HBV病毒株，均有很强的抑制作用。?一项随机、双盲、安慰剂对照的临床试验，应用阿地福韦30mg，每日1次，疗程12周，治疗53例慢性乙型肝炎病人，67%病人血清HBV DNA阴转，ALT亦有明显下降。27%病人HBcAg阴转，20%出现HBeAg血清转换。对拉米夫定和泛昔洛韦治疗出现耐药的病人，应用阿地福韦治疗可获得良好的疗效。?不良反应：阿地福韦的不良反应轻。但剂量超过30mg/d时，可引起肾毒性，值得引起注意。一般推荐剂量为10mg/d。?
5?恩他卡韦(cntacavir,BMS-200475)?
为环氧羟炭脱氧鸟苷。在体外HBV DNA转染的HepG2细胞的药物抗HBV的试验中，在现有的抗HBV的核苷类似物中，它的作用最强。在土拨鼠肝.病毒(WHV)感染的土拨鼠动物模型，口服0.1ng/(kg·d)共12周，血清WHV转阴。以后，每周口服0.1mg/kg，血清WHV继续维持阴性。并可减少肝癌的发生。目前正在治疗慢性乙型肝炎的Ⅱ期临床试验，初步试验证明，此药具有较强的抗HBV作用。亦可治疗对拉米夫定耐药的慢性乙肝病人。不良反应亦很轻。
(三)免疫调节剂?
目前抗HBV药物如干扰素和核苷类似物，只能抑制HBV复制，而不能在人体内彻底清除HBV。免疫调节剂可以提高人体的免疫功能，尤其是对HBV的特异性免疫。可以识别和破坏HBV感染的靶细胞，清除HBV。大量的研究证明，慢性乙肝存在免疫功能低下，尤其是对HBV的特异性免疫功能降低和免疫耐受，以及免疫调节功能异常，使人体内不能清除HBV。因此，在慢性乙型肝炎的抗病毒治疗中，有效的免疫调节剂剂的应用，提高人体的免疫功能是十分重要的。因前用于治疗慢性乙肝的免疫调节剂有胸腺肽、胸腺素(thymosin)α1、左旋咪唑涂布剂、免疫核糖核酸、HBV特异性转移因子和中医中药等。但慢性乙型肝炎的免疫调节剂的治疗目前还存在不少问题，如人体免疫系统的调节和功能呈网络现象，十分错综复杂，而慢性乙型肝炎的免疫调节和免疫耐受机制，至今尚未完全阐明。而目前免疫检测方法尚不完善，还不能反映人体确切的免疫状态和功能。使免疫调节剂还不能根据人体免疫状态进行针对性治疗。此外，免疫调节剂对慢性乙型肝炎的治疗机制，尤其在人体内调节免疫的机制，还很不清楚。因此，目前免疫调节剂在慢性乙型肝炎中的应用，还缺乏针对性，疗效还不够满意，尚有待进一步研究。目前认为提高针对HBV的特异性免疫功能的免疫调节剂，能更有效的清除HBV。如HBV的S和前S2治疗性疫苗、CTL多肽疫苗、DNA疫苗等，但目前尚在实验和临床研究阶段。?
二、病毒性肝炎抗病毒治疗存在的问题 ?
病毒性肝炎的抗病毒治疗，目前存在疗效不够满意，复发率高，有的药物毒性较大和药价昂贵等问题。疗效不够满意的原因有以下几个方面：?
1?肝炎病毒为细胞内寄生和复制。抗病毒药物在细胞内不易达到有效浓度，因此影响抗病毒效果。同时，肝炎病毒如HBV、HCV除在肝细胞中复制外，还在其它组织如胆管、胰腺、淋巴细胞等细胞中复制。抗病毒药物较易清除血中的肝炎病毒，而组织细胞中的肝炎病毒不易被清除，成为复发的重要原因。?
2?肝炎病毒如HBV、HCV等易发生变异，变异病毒常对抗病毒药发生耐药或疗效不好，如HBV前C区变异株感染，干扰素治疗效果差。拉米夫定治疗后的YMDD变异株等。?
3?HBV DNA可与宿主细胞染色体DNA整合，整合后的HBV DNA不易被抗病毒药清除。?
4?HBV DNA在复制过程中，以cccDNA作为复制的原始模板，而目前的抗病毒药物尚不能彻底清除cccDNA。一旦停药后，cccDNA可以作为HBV复制模板，重新转录复制。成为复发的重要原因。?
5?慢性乙型肝炎易形成人体免疫耐受，使抗病毒药治疗效果不佳。?
因此，在研制乙型肝炎病毒新药时，应注意以上存在的问题。?
对今后慢性乙型肝炎抗病毒治疗的展望，应进一步研制新的高效。低毒的抗病毒药，针对不同的抗HBV的靶位和机制进行药物的联合治疗。如二种抗病毒药联用、抗病毒药与免疫调节剂联用等，抗病毒药导向治疗；基因治疗；治疗性疫苗等均是今后抗HBV治疗研究的重要课题。通过科研的进展和大家共同的努力，使慢性乙肝的抗病毒治疗提高到一个新的水平，逐步解决这种危害人民健康极大的疾病。 中华医学会第七次感染病会议的讲课内容
乙肝病毒变异与临床
上海第二医科大学瑞金医院临床病毒研究室(200025)? 陆志檬 张欣欣
病毒变异是生物遗传进化的基本因素之一，乙型肝炎病毒(HBV)变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，也可于应用药物或接种疫苗后。HBV在复制中通过RNA中间体，在DNA-P和逆转录酶活性是有效而迅速的，但DNA-P缺乏校对酶活性，发生核苷酸替代变异后难以修正。已发现HBV序列的变异在基因组各个区域均可发生。不同的病人表现为不同的基因型，最近已确定HBV有7个基因型(A-G)，并与地理因素相关。在美国和欧洲主要是基因型A和D。B和C主要在中国和东南亚。已发现基因型与临床预后和治疗反应相关。基因型在漫长的岁月中突变累积形成的基因组结构，在这里的变异是指基因型以外的变异，包括HBV的前C/C、X、前S/S和DNA-P多个区域均可发生突变、插入或缺失、移框突变等，通常把病毒株分为野毒株(wide strain)和变异株(variation strain)，一些变异株对临床预后和病毒学反应具有重要意义。现分述于下。
前C/C基因变异
前C1896位(A83)的变异：是HBV中最常见的变异。1989年英国学者Carman等首次报导了HBV前C1896位的突变。野毒株1896位是G，变异为A，A83氨基酸(TGC)变异为终止密码(TAG)，使前C蛋白的翻译终止，从而使eAg不能合成，但它并不影响报道复制，因此临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)，而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎。进一步研究该变异的分子基础发现前C区含一个发夹形纤襻结构，在1858位与1896位间，将不稳定的T-G对(与基因型有关)变异为T-A对，使前基因组RNA结构更稳定，更有利于病毒复制，并可导致优势株。
在分析HBV变异的临床意义时，可从慢性HBV感染者的动态血清学、临床表现与前C区变异关系时发现慢性感染HBeAg(+)期，病毒高滴度，但临床常无加重。随着感染持续，出现了HBeAg(-)前C变异株，并逐渐累积，此时血清学仍可为HBeAg(+)，但血清中已可同时检测野毒株和变异株，其中野毒株逐步被清除，临床上常伴肝炎发作；随着前C1896变异株选择优势的发展，血清学可转换为HBeAg(+)，但在血清中仍可检测到HBeAg分泌的野毒株，在临床上既可表现为病情加重，也可表现为病情缓解；若选择的结果进入均一eAg不表达的变异株，则ALT可轻微升高，但病情可无明显加重。
总之，在慢性HBV感染过程中，野毒株和eAg(-)变异株的并存，常与疾病的加重有关。相反 ，在病情稳定的患者中，仅发现单一的野毒株或HBeAg(-)的变异株。有关eAg消失后前C区变异与病情活动，国内外已有不少相关报导。但对此也有不同观点，认为前C区变异是普遍现象，与疾病严重似无明显相关。这可能涉及变异分析技术因素，包括方法敏感性、定量分析、动态观察或定量分析等。
前C1896位(A83)和1899位(A86)的双变异：在HBV前C1896位(A83)变异常伴随1899位(A86)变异。即在1899位的G→A变异。这样就连成一个短序列为TAGGA。已发现该变异可能增强核糖体的结合，使核壳蛋白可活跃转译，认为1899位变异是1896变异代修性措施。这种双变异具有优势选择，使HBV有较高复制水平和传染性。
C基因的变异
近几年来几项研究表明在病毒清除期，基因组较保守的部位发生了选择性变异，以C区中部的变异或缺失，特别是错义变异至少可涉及4个B细胞靶位、2个细胞毒T细胞(CTL)表位和3个Th细胞表位。
C区的变异与临床相关性研究：在codon 130的变异是T、B细胞共有的表位。A Okumara分析了变异株(Core 130 Thr)和野毒株(Core 130 Pro)在慢乙肝中与肝损害关系，结果表明在5例慢乙肝，病情加重，ALT升高时C130(Pro-Thr)变异株占优势，而在ALT高峰下降后野毒株为优势，而在3例慢性携带者野毒株(C 130 Pro)始终占优势。作者认为HBVC区Codon 130是最重要的免疫原性区，Thr/Pho比值的增高是免疫筛选的表位和B细胞表位和HBc/e抗体结合决定簇、CD4+细胞Th细胞和B细胞识别区段，可部分逃避免疫反应，使肝脏损害持续存在，常与前C区终止变异同时发生或在前C变异后再出现，与进展性抗e(+)慢性肝病相关。?隋礼丽、骆抗先等研究了HBV/C基因变异对宿主细胞HLA表达的影响，结果发现：V60、G87和L97变异株与野毒株相比可增强HLA的表达，从而可解释CTL对宿主细胞杀伤性增强，是病毒变异和疾病进展相关原因之一。
X基因的变异
X基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区变异影响到病毒的转录和复制。研究较多的是核心蛋白的启动子(CP)。
慢性乙型肝炎BCP区的变异：BCP的变异是多点和复合的，主要是1762(A-F)、1764(G-A)的双变异，BCP区是富含AT区域，具有肝脏富含因子的独立结合点，变异的BCP可改变这种结合，降低前C的RNA转录，最终使HBeAg表达减少，平均降低70%。BCP的变异还可增强前基因组RNA转录增强(2～3倍)，病毒包装有很大增强(10×)。
最近对3P启动子CCTTA附近的缺失变异可影响2?4KbPre-S1mRNA和2?1KbSmRNA的转录表达，与外科肝移植后发生胆汁性淤积有关。Ha?Lee则发现在Pre-sp转录起始编码的缺失。
目前认为X基因区BCP、SP或PreSP的变异改变了HBV基因表达的平衡，与HBV持续感染相关。
暴发型肝炎患者CP1638位(T-C)、1673位(C-T)、1727位(A-T)、1730位(C-G)变异：出现较多。Sato等发现在暴发型肝炎或急性自限性乙肝中，CP和前C区联合突变或单独出现，尤其是A基因型优势株地区所发生暴发型肝炎有意义。
前S/S基因变异
HBV包膜蛋白是宿主体液和细胞免疫反应的靶位点。前S/S变异可使HB疫苗或HB免疫球蛋白保护无效。有些部位的变异还步及血清学标志的改变而影响诊断的灵敏度。
乙肝疫苗免疫后仍出现HBsAg(+)的小儿中，发现了HBsAg"a"决定簇的变异株，可有一点或多点变异，其中最重要的突变是145位的甘氨酸替代了精氨酸，这是由于HBV逃避宿主的免疫压力选择性结果，有时这种变异株在母体内为少数，而在疫苗免疫后的小儿却成为优势株。在肝衰竭进行肝移植后应用单克隆抗体或高效价HBeAg治疗后也可出现HBeAg变异，这些突变大多数发生在"a"决定簇145位的甘氨酸-精氨酸。
还有报导则在HBeAg(-)、HBV DNA(+)患者中发现124位半胱氨酸缺失，导致HbeAg的分泌障碍，而使免疫学标志出现HBeAg(-)。
P基因变异
P基因是最长的开放读框，与C、S与X基因重叠。P基因主要编码DNA-P，该基因共分成5个区(A、B、C、D和E)。这些区域是较保守的，参与核苷酸或模板结合，并且具有催化活性。近年来，在用核苷类药物治疗患者中，出现了P基因突变的报道，体内外试验表明这些突变株与药物耐药相关。
拉米呋啶引起YMDD突变：拉米呋啶(Lamivudine,LAM)是当前HBV治疗广泛应用的核苷类似物，它能显著降低HBV DNA水平(4～5logs)，并可使ALT正常化和肝组织学改善。若长期治疗，则在DNA-P的保守区(C)的YMDD基序发生变异。目前认为变异的耐药机制是由AA552的蛋氨酸被颉氨酸或异亮氨酸替代(即M552I/U)，使此链缩短，结合点变大，不再适合拉米呋啶结合而导致耐药。
LAM引起YMDD(C)和B区的联合变异：除YMDD为主要变异外，常合并上游(的L528M的变异。根据不同的变异形式可分成三组(图)。
HBV-DNA聚合酶
氨基酸序列 ……FLLAQ………………YMDD……
密码子 528 552
Ⅰ组变异 ↓ Lto M ↓M to V/l
?……FLMAQ …………… YVDD……
Ⅱ组变异 YIDD ……
Ⅲ组变异 ……FLMAQ …………… YIDD ……
Y=酪氨酸 M=蛋氨酸 D=天冬氨酸 L=亮氨酸 V=颉氨酸 I=异亮氨酸
??
最近研究(Hepatology,2000，1318-26)表明在LAM长期治疗中可有HBV-YMDD变异株被清除，还可出现新的突变株来取低YMDD变异株，如A529T，在表面抗原基因产生终止密码，导致HBeAg分泌减少，体外试验表明对LAM耐药，这些变异也可引起持续性慢性肝炎的发作。张欣欣，刘传苗等发现在LAM治疗过程中，血清HBeAg发生转换，但HBV DNA仍(+)者，检测其pre-c 1896位变异导致终止密码，并常可联合YMDD变异(待发表)。
LAM治疗和肝炎突发：在美国和亚洲二个LAM临床试验报告了HBV DNA下降了2～3个logs。二年的HBeAg阴转率为27%，YMDD的发生率分别为32%和14%，但随着治疗的延长，在亚洲40%发生了LAM的耐药变异。LAM相关的ALT突发见于服药期间变异株患者，有部分患者停药后也发生了复发。
台湾Liao对55例病人经LAM治疗104周，其中32例(60%)检测出YMDD株，变异率为58．2%。32例变异者中有30例出现ALT的升高(93．7%)。其中13例(40．6%)出现肝炎急性发作。在发作前HBV DNA水平升高至顶点，在1～4周后ALT升高达顶峰(247～2010U/L)，发作后8例出现eAg阴转，3例出现失代偿，但在血清eAg转换后，病情恢复。作者认为YMDD变异株出现急性发作或急剧变化可导致HBV清除，其病程和临床病理特征与HBV野生株慢性感染相似。
对LAM耐药致肝炎急性发作的理解，认为应从HBV感染的免疫致病机理包括宿主的免疫因素和病毒的复制。慢性HBV感染者常显示抗病毒T细胞免疫的低反应性。在发作前可先观察到一个高的病毒滴度，接之可激活抗HBV细胞免疫反应，此免疫反应直接针对感染的肝细胞，导致肝细胞坏死和临床肝炎表现。当体内耐药变异株增多，复制增加时，也可激发机体免疫反应引起临床肝炎的突发。若强有力的免疫反应能控制病毒的复制，则结局是病毒清除(eAg转换，HBV DNA消失)和疾病恢复。如果免疫反应不足以消灭病毒，则肝功能可持续异常。由于LAM是一个直接抗病毒的药物，机体内在的免疫反应十分重要，治疗前ALT增加5～10倍治疗结局良好。因此LAM长期治疗后YMDD变异株发展后，内在的细胞免疫反应也决定了是否发生肝炎发作及其肝损害的程度。
YMDD耐药变异的防治：随着用药时间的延长，核苷类药物易引起病毒变异，导致耐药。为了
减少耐药性的出现，一方面可以联合用药。从理论上讲，IFN和核苷类药物在不同的靶位点联合应用，可减少耐药株的出现。Schalm等报道称230例患者随机分成3组(INF、LAM、LAM-IFN)，结果52周时的三组HBeAg阴转率分别为19%，18%和39%。联合治疗的疗效更明显。但对此也有相反意见，在美国、加拿大、欧洲进行的IFN和LAM联合治疗疗效也不佳。有人报道，对LAM耐药株M5522变异可用LAM-FAM序贯治疗可抑制病毒复制，但不同意见者认为FAM在P区也可出现L528M变异，该药所出现的P区其他突变V521L，P525L、W501E等，亦可引起肝炎突发。阿德福韦是一个广谱的抗病毒药物。在HIV治疗过程中未发现有耐药变异。Xiong等重组含有M512I、M512V、L528M、M552V变异的HBV株，对LAM耐药的阻滞常数较野毒株增加了8.0、19.6和25.2倍，但所有变异株对阿德福韦均敏感，且对联合变异也有效。
对于YMDD变异导致急性发作和病情急剧变化是否继续应用LAM，一般认为LAM对野毒株继续有效，应继续用药，但在LAM变异株产生病情急剧变化，特别SB＞50μmol/L时应予停药。最近，omeya T报道了一例LAM耐药引起急剧变化时(SB 4.9mg/L，ALT 1230IU/L，HBV DNA 68Meq/ml)继续应用LAM同时加用IFN-α使变异株清除，LAM使变异株清除，从而使病情缓解。
结语：HBV变异是在慢性感染过程中为适应生存环境而自然发生的，在HBV前C/C、X、前S/S和DNA-P多个区域均可发生变异。有些变异并无生物学意义，但有些变异经体内外试验证实是与临床相关的。在长期应用核苷类药物中，HBV的变异也会不断发生，需动态监测变异的发生、发展与临床关系。在治疗策略上，可针对HBV复制过程的靶位点，开发新的药物，并设计联合治疗。 氧化苦参碱是从中药苦豆子中提取的一种生物碱水溶液制剂，其中氧化苦参碱（oxymatrine）占98%以上，分子式为C15H24N2O2.H2O，分子量为282，其他还有极少量的槐果碱、槐胺碱、槐啶碱等几种。
苦豆子（sophoraal opecuraidesl）为豆科槐属植物。别名苦甘草、苦参草、苦豆根及西豆根。我国约有12种，集中分布于北方的荒漠地区，尤以宁夏、甘肃、青海、新疆及内蒙古为多。全株味极苦、性寒，具有清热解毒、抗菌消炎作用，民间用其根治喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等。我国药典1977年版已将“苦豆草片”加以收载，主治痢疾及肠炎，国外早在30年代初苏联开始研究，国内开始于1972年，国内外研究的重点均放在生物碱上，目前国内自苦豆子植物中提取、分离、鉴定的生物碱主要有氧化苦参碱、苦参碱、槐果碱、槐胺碱、槐啶碱、苦豆碱、金雀花碱、N-甲基金雀花碱等几种。药理方面国内70年代主要研究了苦豆草煎剂、苦豆草干浸膏、苦豆草总生物碱及生物碱单体苦豆碱、槐啶碱及槐果碱的药理作用，尤其以槐果碱的研究较为详细，有平喘、抗菌、消炎、抗肿瘤等作用。近15年对氧化苦参碱及苦参碱的研究较多，但主要限于实验研究，其中有氧化苦参碱对小鼠实验性肝损伤保护作用的观察；对小鼠微粒体药物代谢酶的诱导作用研究；对-型变态反应的抑制作用；氧化苦参碱对淋巴细胞增殖的影响及抗心律失常的实验研究等，临床主要用于过敏性皮肤病及白细胞减少的治疗。1994年上海市传染病医院实验发现氧化苦参碱有抗麻鸭乙型肝炎病毒作用，上海市多家综合医院协作采用氧化苦参碱治疗慢性乙型肝炎均取得良好疗效。
1996年12月由卫生部指定的上医大附属华山医院，北京佑安医院完成40例随机双盲验证及其它有关药效、不良反应的基础论证工作，1998年2月24日卫生部批准氧化苦参碱为国家治疗慢性乙型肝炎五类新药。
1998年8月中华医学会重点推广工程专家认证决定博尔泰力（苦参素注射液）治疗病毒性肝炎列入重点推广工程项目，在全国推广使用。近几年氧化苦参碱在治疗病毒性肝炎方面的主要进展如下。
一、氧化苦参碱具有直接抗乙型肝炎病毒作用
1.氧化苦参碱可抑制2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg
上海长征医院采用含HBV基因转染的2.2.15细胞株为研究对象，观察不同浓度氧化苦参碱（Oxy）作用不同时间对细胞培养上清中HBsAg及HBeAg水平的影响及其细胞毒性，计算Oxy对HBV抗原的抑制率及治疗指数（Ti），并同无环鸟苷（Acy）相比较，综合评价Oxy的体外抗HBV效果，结果：Oxy在50μg/ml-2000μg/ml浓度范围内剂量相关性抑制2.2.15细胞分泌HBsAg及HBeAg，且随着药物作用时间的延长，Oxy对HBsAg及HBeAg的分泌抑制率逐渐增强，在药物作用第20天，对HBsAg及HBeAg的分泌抑制率最高，可分别达93%及63%，虽有一定的细胞毒性，但对HBsAg及HBeAg的TI分别达到63及6.2。Acy对HBsAg及HBeAg也有较高的抑制率，在1mg/ml浓度时，作用于细胞20天，对HBsAg及HBeAg的抑制率分别达到96%及60%，但显示出较高的细胞毒性，其抑制HBV的治疗指数明显低于Oxy。实验证明Oxy可抑制2.2.15细胞分泌HBsAg及HBeAg，细胞毒性低，治疗指数高，提示直接抑制乙肝病毒活动为Oxy抗HBV作用机理之一。
2.氧化苦参碱可抑制乙肝病毒转基因小鼠抗原的表达
上海长征医院以乙肝病毒全基因组转基因小鼠ICR(TgN,HBV 1.2copy)为动物模型，采用ELISA、免疫组化和电镜等方法检测不同剂量Oxy治疗不同时间小鼠肝脏内HBV抗原含量的变化，研究Oxy的抗HBV作用，结果表明Oxy能降低HBV转基因小鼠肝脏内HBsAg及HBeAg含量，且对两者作用一致，Oxy200mg/kg治疗30天时，6只小鼠肝脏内HBsAg及HBeAg均转阴，但随着治疗时间延长重又出现阳性表达，这可能同转基因小鼠处于免疫耐受有关。
二、氧化苦参碱能抑制胶原活动度和防治肝纤维化
上海长征医院采用四氯化碳（CCL4）造成大鼠慢性肝损伤纤维化模型，同时采用Oxy防治，并动态观察血清丙氨酸转移酶（ALT）、IV型胶原（IV-C）、透明质酸（HA）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平以及肝脏组织病理变化，通过计算机图象分析系统，分析肝内纤维组织增生情况，结果表明，Oxy治疗组血清ALT、IV-C、HA、TNF-α水平和肝组织内炎症活动度以及纤维组织增生程度均低于模型组，且大剂量治疗组又低于小剂量治疗组，表明Oxy有减轻肝脏炎症活动度，抑制肝内胶原合成及抗肝纤维化作用。
上海长征医院以NIH3T3成纤维细胞为靶细胞，应用MTT法、Northern blot杂交及免疫细胞化学技术，研究发现当Oxy浓度大于62.5 ug/ml时，成纤维细胞增殖活性受到明显抑制，并呈剂量依赖性，受抑制的细胞体积小、细胞质少，多呈梭状或圆形，细胞核小，处于核分裂期细胞少。Oxy并能明显抑制成纤维细胞III型前胶原mRNA及转化生长因子（TGF-β1）的表达，提示以上发现可能是Oxy抑制肝纤维化的机理之一。
三、氧化苦参碱可阻断肝细胞异常凋亡
上海长征医院采用撤除苯巴比妥钠（PB）诱导的肝细胞凋亡的实验模型，研究氧化苦参碱及甘草酸对肝细胞凋亡的影响，以肝体重比、肝脏DNA含量、肝组织病理改变及原位细胞凋亡TUNEL标记为指标，观察Oxy150 mg·kg-1及甘草酸50 mg·kg-1，腹腔注射对撤除PB后引起的小鼠肝细胞凋亡影响，结果模型组小鼠肝体重比及肝脏DNA含量分别回落16.3%及32.4%，Gly组小鼠肝体重比及肝脏DNA含量分别回落16.1%及28.9%；Oxy组小鼠无明显回落，组织学检查及凋亡细胞TUNEL标记：模型组及GL组小鼠肝细胞出现典型凋亡样改变，TUNEL标记阳性，而Oxy组小鼠肝组织未见明显凋亡改变，实验结果表明Oxy可阻断PB诱导的小鼠肝细胞凋亡，而甘草酸对其无影响。
四、氧化苦参碱对实验性小鼠肝衰竭具有保护作用
长征医院采用内毒素（LPS）和D-氨基半乳糖（GalN）致小鼠产生暴发性肝衰竭，同时分组以氧化苦参碱治疗观察，结果表明氧化苦参碱治疗组小鼠血清以ALT及TNF-α水平明显低于模型组，肝组织损害程度及Fas、FasL表达强度均较模型组减轻，提示氧化苦参碱可能通过下调TNF-α水平及抑制Fas、FasL表达，从而阻断LPS所致肝细胞异常凋亡及坏死。
五、氧化苦参碱治疗慢性肝炎取得良好疗效
长征医院采用氧化苦参碱治疗慢性乙肝64例，与-干扰素300万单位治疗慢性乙肝52例比较，氧化苦参碱组ALT复常率81.6%，胆红素复常率69.9%，干扰素分别为73.7%和64.0%（p<0.05），氧化苦参碱组HBeAg阴转率44.4%，HBV DNA阴转率45.3%，干扰素组分别为48.0%和51.9%（p<0.05）。氧化苦参碱组中CAH患者HBeAg及HBV DNA阴转率分别为61.0%和61.9%，而CPH分别为15.4%和15.4%，CAH+CL分别为11.1%和11.15%，表明治疗病例的选择对治疗有直接影响，氧化苦参碱治疗患者除注射部位轻度疼痛外，未见其他不良反应，本组合并有白细胞及血小板降低的慢性乙肝患者，经过氧化苦参碱治疗后1/3患者白细胞和血小板恢复正常，或有不同程度提高，同时发现氧化苦参碱治疗组血清型胶原及型胶原及透明质酸水平较治疗前均有显著下降，表明氧化苦参碱治疗慢性肝炎时同时具有抑制胶原活动度和肝纤维化作用 感谢各位发言
关于病毒变异问题成军教授有他的观点，和我们认为的变异不同，他认为血中的病毒本身就是不同的，虽然达不到8％的亚型区分，一般小于5％，但这点已经足以引起机体的变化了，所以，当一个病人自身病毒本来就不一样，那么前后比较的不同（变异）就真的那么有意义么？
从YMDD变异中我们能有许多启示，YMDD株可能在治疗前为优势株，但加用拉米后选择了YIDD或者YVDD株，后者成为优势株，至于是不是后者真的就如我们认为那样，致病力弱于野生株？从体内不同的病毒共同存在这点出发，就不一定正确了，因为不除外少数（劣势株）有更大的临床意义，很有可能优势株并没有什么致病力，否则患者不会出现缓解期携带大量病毒可能。
这种概念就是成军教授所说的准种，就是同一个体中的病毒基因会有漂移变异现象。
这种理论符合进化论观点，而我们平时测序也好，分析也好，可能多数时候在做无用工，因为我们并不知道我们分离的病毒是不是真的致病病毒，所以在乙肝病毒研究方面一直没有太大进展，各项研究结果有天壤之别，发现的点变异层出不穷，但用来解释临床又无能为力，只有拉米和阿的的耐药变异选择形成绝对优势株变化，才有一定临床意义。 膦甲酸钠(可耐 注射剂):
膦甲酸钠注射液通过直接和/或间接的作用，明显的作用于鸭乙型肝炎病毒，抑制病毒DNA复制，强烈而显著地降低血清DHBV DNA水平，部分实验动物血清DNA转为阴性，具有较好的抗病毒作用。病理检查未见膦甲酸钠注射液有肝脏病理毒性作用，而有一定的鸭肝病理改善作用。膦甲酸钠注射液作为有希望的肝炎治疗药物，值得推荐临床使用和尽早推广应用。
而磷甲酸钠为非核苷类药物,其抗乙肝病毒机制较核苷类更直接,并且能抑制ＣＤ8、ＮＫ细胞、内因子等的活性.
采用核苷甙类磷甲酸钠抑制ＨＢＶ病毒逆转录酶,以后再用干扰能治疗。这样既可以联合抗病毒,也能够改善单纯采用核苷甙类药物复发率高的结局。参考:叶维法,钟振义.肝炎学大典[Ｍ].天津:天津科技出版社,1996.817-819.
干扰素综合增效治疗
（1）对于IFN受体（IFNR）表达低下或缺陷所致干扰素治疗完全无反应病人：采用干扰素剂型改进 最简单是脂质体技术应用，而IFN本身去/脱唾液酸化对肝脏有特异的靶向作用，而脂肪酸基团掺入有利于胞膜IFN受体缺无病人的治疗；
（2）对于机体高铁负荷导致的机体对干扰素低反应（脱敏即IFN受体（IFNR）活性/功能低下/低纯）所致干扰素治疗低反应病人：对于铁蛋白高可采用去铁疗法，可采用去铁胺/敏及半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、硫普罗宁、VIT E等治疗；
（3）对于自由基大量产生所致脂质过氧化和肝纤维化明显而导致的机体对干扰素低反应（脱敏即IFN受体（IFNR）活性/功能低下/低纯）所致干扰素治疗低反应病人：应用抗过氧化和抗纤维化治疗如还原型谷胱甘肽、654-II、丹参制剂等；
（4） 病毒复制活跃、病变活动严重而免疫异常表现T细胞扩增低下：采用阿德福韦（Adefovir)、贺普丁（拉米呋啶，Lamivudine）、病毒唑(利巴韦林，Ribavirin)、无环鸟苷(阿昔洛韦，Acyclovir)、 单磷酸阿糖腺苷（AMP-ARA)、 泛昔洛韦(Pancyclovir,丽珠风)、 更昔洛韦(Gancyclovir）等；
（5）病毒复制活跃、病变活动严重而免疫异常表现T细胞扩增亢进：采用可耐（磷甲酸、AMP-阿糖腺苷等等抗病毒药物）及聚肌胞、苏拉明、中药清热解毒药物及甘草甜素片 强力宁 甘利欣等；
（6）免疫低下/耐受：采用免疫生物疗法，如抗原提呈细胞耐受用FL3-Ligand/IL-1/IL-3/GM-CSF/TNF/IL-4/IL-12/IL-18/BPO（血小板生成因子）等，对有母婴传播史的HBV携带者可试GM-CSF+IL-4+HBV疫苗、TNF序列疗法。而T细胞低下/耐受用抗病毒药学药物+干扰素治疗同时结合IL-2/7/12/15/18，体液免疫低下用HBV抗原、高效价免疫球蛋白、左旋咪唑、IL-4、TNF等等。
（7）其他IFN增效剂应用：如甲状腺素、DHEA或雌激素、胸腺肽、中药扶正药物如猪苓多糖、虫草头孢菌丝等等； 好在总算看到一位战友提到氧化苦参碱了,在国内的一些会议上讲到乙肝抗病毒治疗的时候,许多专家都在有意无意地回避在一个问题:氧化苦参碱到底有没有抗HBV的作用?为什么提到抗HBV治疗的药物时总是只讲到干扰素\核苷类似物,避而不提氧化苦参碱?其原因是氧化苦参碱生产厂家太多,没有一个拿到专利的,因此也就没有厂家愿意拿出大量的经费去作多中心的临床研究,或者是拿出经费去买大牌专家的嘴!
本人在99年与同事一起开展干扰素治疗乙肝,当时所用的干扰素是国内知名品牌,300万单位将近200元,一个疗程近20000元,然而12位适应症很好的患者最终仅有一位获得完全应答,而我们用博尔泰力治疗乙肝三个月是完全应答率竟然高达32％,远高于所谓第一线抗HBV药物的干扰素,随后我们一直用苦参素治疗乙肝,系统开展了"拉米夫定联合博尔泰力治疗慢性乙型肝炎的临床研究"(论文发表在临床肝胆病杂志.2001.017(003).-165-166)、博尔泰力治疗乙型肝炎活动性肝硬化的临床研究（中西医结合肝病杂志.2002.012(003).-141-143）、博尔泰力治疗拉米夫定耐药性乙型肝炎的临床研究（临床肝胆病杂志.2003.019(002).-106-107）、苦参素治疗慢性乙型肝炎312例回顾性分析（即将发表在世界华人消化杂志上），当然我们这些小样本研究不能说明什么，但我们又从的理由相信苦参素治疗慢性乙型肝炎有肯定的疗效！ 随着各种新药的出现，我们的治疗似乎越来越有希望了，但病毒是不断进化的，随着药物的出现，病毒将向耐药方向转化，这种转化可能是降低病毒致病力，也可能增加致病力，我们不能猜测进化的方向。
这种进化是远远快于人类和高等生物的进化速度的，由于病毒复制校正系统很差，出现碱基序列改变会直接导致蛋白表达改变，病毒的开放读码框架是相互重叠且几乎很少有不表达蛋白的基因序列，这与高等生物含有大量的重复无效基因不同，导致病毒基因的改变会直接影响到病毒性状的改变，使之更容易发生物种进化。
到目前为止，所有正在研究中的药物（约20种）都不同程度发现病毒抵抗变异，大家喜欢用优势选择来解释这种事件，病毒变异是不断存在的，在还没有应用药物之前，变异株作为弱势株存在，而野生株作为优势株，应用药物之后，变异株存在生存优势，就被选择成为优势株，需要强调的是，这种选择并不会一定降低病毒致病力，事实上，致病力很强的病毒株往往会是弱势株，他们在自然进化中并不占有优势，致病力较弱的病毒株更容易在自然选择中存在的更好。
我们讨论了目前几乎所有的热点药物，当我们旁观这些药物的时候，或者在以后我们应用这些药物的时候，不要让厂商的数据冲昏了头脑，我们更应该注意到以上观点，变异株并不一定致病力弱，相反，这些在自然选择中的弱势群体往往会是致病力更强的毒株。
我们能否治愈乙肝？到目前为止这个目标还是遥不可及的。
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