核磁共振讨论
一个化合物合成后，需进行其结构的鉴定，其中核磁是鉴定当中一个很重要的方法在1HNMR图谱中活泼氢信号变化多端，有的峰尖锐，有的峰较宽，有的峰积分面积明显较小，有的峰和其它质子信号重叠，有的峰几乎与图谱基线一致等。产生上述现象的原因一般分两类情况，也可以分为内因和外因。内因是指分子结构引起的，如羧基的活泼氢、螯合的羟基、烯醇羟基、酰胺的活泼氢和一些交换速度比较慢的活泼氢一般表现为宽单峰（br.s），交换速度快的活泼氢表现为比较锐的单峰，羟基质子和同碳氢发生偶合时则表现为三重峰（t）或二重峰（d）。外因 原则上是与样品浓度、温度、溶剂、样品中的水分等因素有关。但研究者关心的问题是如何如何识别活泼氢信号。下面介绍几种识别活泼氢信号的方法。（摘自：汪茂田等《天然有机化合物提取分离与结构鉴定》化学工业出版社，2004）
（1）重水交换是最经典和常用的识别活泼氢的方法， 但也有不方便和不足之处。
一是重水交换必需重新测定一次图谱，二是较大的水峰会干扰δ4.7ppm左右的样品信号。如果样品同时还要测定H-HCOSY和H-CCOSY谱的话，可用这些图谱来识别活泼氢，必要时再做重水交换实验，当然重水交换的优点是隐藏在其它信号中的活泼氢信号可以被消除。绝大多数情况下，重水交换的速度是很快的，有一些化合物，如酰胺的活泼氢交换速度较慢，加入重水后要放置一段时间或稍微加热后测定。
2）由H-CCOSY谱鉴别活泼氢信号
因为活泼氢不和碳直接相连，故和碳没有相关峰的质子信号应是活泼氢的峰。所以当一个化合物同时有1HNMR和H-CCOSY 谱的话，就不必刻意由1HNMR谱识别活泼氢信号，两种谱结合起来问题就容易的多了。例如头孢噻呋的HMQC谱中的δ9.54（1H,d）信号没有和碳的相关峰,它是酰胺的活泼氢信号，δ7.16（2H,s）是NH2的信号，和碳没有相关峰。
当活泼氢不和同碳质子发生偶合时，活泼氢在H-HCOSY谱中没有相关峰。当然要注意孤立质子的共振信号以及由于双面夹角接近或等于90°时的特定质子的信号 （单峰或宽单峰），但这些质子在H-CCOSY谱中有相关峰。在活泼氢与同碳质子发生偶合的情况下，缺乏经验的研究者可能不易从1HNMR和H-HCOSY图谱上看出来，这时可借助H-CCOSY谱来识别。
由HMBC谱也可以获得活泼氢连接位置的信息，当采用氢键溶剂如氘代二甲基亚砜或氘代吡啶测定NMR图谱时（要尽可能干燥），活泼氢由于能和溶剂形成氢键，使其不易发生交换而比较“固定”，在HMBC中可以检测出这些活泼氢与邻近碳的远程偶合，这对归属不同的活泼氢在结构中所处的位置非常有效。
3） 变温实验识别活泼氢
在活泼氢信号与其它信号发生重叠或部分重叠时，在1HNMR谱中往往不能肯定地识别活泼氢信号，这时样品管不要取出，接着做升温实验，一般可升到50-60度，温度升高活泼氢信号向高场位移。将常温测定的图谱与升温测定的图谱比较来识别活泼氢信号。
一个查有机物的核磁谱图的好链接
[url]http://www.aist.go.jp/RIODB/SDBS/cgi-bin/cre_index.cgi[/url]
NMR技术在构效关系研究中的应用
王明安
(Key words Structure-Activity Relationship, 13CNMR, SAR by NMR
摘要 介绍了核磁共振技术在构效关系研究中的应用，包括：1) 13C NMR在构效关系研究中的应用；2) SAR by NMR 新方法的应用，重点介绍第二种方法。
关键词 构效关系 13C核磁共振 SAR by NMR
核磁共振技术在各个领域中已获得广泛应用。在创制新医药，新农药的过程中，1H、13C、31PNMR等对于表征化学结构起着至关重要的作用。与此同时，化学结构与生物活性间的构效关系研究对于新药的分子设计无疑起了巨大的推动作用。原有的QSAR研究中主要使用电子效应参数、立体效应参数和疏水性参数。除疏水性参数外，电子效应和立体效应是影响核磁共振化学位移的主要因素。因此，如何使用这两种效应，把核磁共振化学位移与构效关系研究联系起来，成为化学家、药学家及生物学家共同追求的目标，将会开创新药分子设计的新局面。为此，本文介绍两种探索方法，并重点讨论后一种方法。
1 13C NMR在结构-活性关系研究中的应用
早在1986年, Sakamoto等[1]在研究多环、氯代单环芳烃的致癌活性和化学结构的关系时，根据芳香族化合物的电离能在一定范围内显示有致癌活性，并随电离能的减小而致癌活性增加的规律，以及芳香族化合物的13C NMR化学位移与电离能及每个碳原子的电子环境密切相关的原理，提出可以用13C NMR化学位移来度量一个化合物是否具有致癌活性。一个i核的13C NMR化学位移在具有相近的平均激发能时，顺磁性贡献是主要影响因子：
2 通过NMR谱研究结构-活性关系(SAR by NMR)
发现新药的传统方法是通过从化合物库或天然产物中筛选具有活性的先导化合物，再合成结构相关的类似物进行优化，这是一种费时、费力的方法，也需要偶然的机遇。药物合理设计(rational design)的方法在开发新药过程中扮演了非常重要的角色，在优化过程中也依赖于个人的经验和利用分子结构的知识，但由于过分强调合理设计，仅仅通过分子设计要得到人们预期具有优良性能的药物并不总能成功，因此人们开始醒悟，药物合理设计的方法并不总是有效。组合化学(combi-chem)的方法给新药的研究提供了新的推动力，不久人们也开始觉醒，在这种新方法发展过程中，已经受到明显的限制[11,12]。最近，美国Abbott实验室的Fesik研究组发表了一项开创性的研究工作，巧妙地将合理设计与组合化学的优点结合起来，并将这种方法称为“SAR by NMR”，即通过NMR谱研究结构-活性关系[13,14]，从而为新药研究提供了新的思路和启示。
“SAR by NMR”这种新方法包含了5个步骤：(1) 从低分子量化合物库中筛选并识别结合于靶标蛋白(酶)第一配体；(2) 优化结合于这一部位的第一配体；(3) 筛选并确定结合于第一配体部位的邻近部位的第二配体；(4) 通过筛选结构相关类似物优化结合于这一部位的第二配体；(5) 通过多维NMR方法或X射线衍射方法确定三元配合物中两配体的位置及取向，然后再根据这一结构信息将两配体通过一个连结子(linker)连接起来，以合成高亲和力的配体-目标药物分子，因为这种方法主要依赖于NMR来完成,所以称之为“SAR by NMR”。图2是“SAR by NMR”方法的原理图。
究竟如何识别结合于目标蛋白(酶)上的第一、二配体是这项技术的核心。Fesik研究组在一篇专利中详细介绍了识别的方法，即通过识别加入配体前后在二维异核单量子相关谱(2D 15N/1H HSQC)中酰胺1H或15N化学位移的变化来确认[15]。根据Fesik等的经验， 15N标记蛋白在500MHz NMR谱仪上，可以在10～15min内获得一张分辩好的2D HSQC谱，使用自动换样器，则每天可以测试100个样的2D HSQC谱，如以10个化合物的混合物为一组进行测试，每天可筛选1000个化合物。在另一篇专利中，详细介绍了根据上述方法得到第一、二配体后，如何设计结合于目标蛋白分子上的新化合物的方法，即通过确定三元配合物中配体的确切部位及空间取向，用连结子连接两个配体形成新的化合物，并保持以前相同的空间取向以保证进入相同的结合部位[16]。
目前应用这种新方法取得了巨大的成功。免疫抑制剂FK506(1)结合蛋白FKBP与FK506结合后可抑制钙调磷酸酶(Calcineurin，一种丝氨酸-苏氨酸磷酸酶)并阻碍T细胞活化，FKBP对器官移植中免疫反应的抑制是很重要的。Fesik等人[13,14,17]用2D HSQC谱方法，筛选出化合物2对FKBP显示了最高的亲和力(用Kd表示, Kd=2.0uM, Kd可通过2D HSQC谱中酰胺化学位移的变化作为化合物浓度的函数来获得)[18,19]，这个化合物未作任何优化作为第一配体；在饱和量的化合物2存在下，从化合物库筛选到一个与FKBP亲和力Kd为0.8mM的化合物3，并根据HSQC谱中化学位移的变化说明化合物3的结合部位与化合物2的结合部位相邻。在此基础上，对化合物3进行优化，筛选到一个与FKBP亲和力Kd为100uM的最优配体9。通过对化合物2、9与FKBP三元配合物的同位素滤波NMR(isotope-filtered NMR)研究所得的模型，认识到化合物2的甲酯基与化合物9的苯甲酰基环上的羟基很近，于是通过连结子设计合成了5个化合物10～14，结果得到的5个化合物对FKPB的亲和力Kd均达到nM级,其中化合物10的Kd为19nM，这是FKBP的一个高亲和力配体。图3是对这一研究过程的总结。
子宫金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases)是一组隶属于锌的内蛋白酶，包括胶原酶，明胶酶和基质溶酶(collagenaes, gelatinases and stromelysin)，子宫退化和组织再生过程都与这种酶有关，当过分表达或调节不当都会伴随病理症状如关节炎或肿瘤转移。Fesik研究组[18]最近报道了通过“SAR by NMR”方法，发现了基质溶酶的非肽类抑制剂。用HSQC谱方法从化合物库中筛选到乙酰羟胺(CH3CONHOH,15)对基质溶酶的亲和力很弱，Kd=17mM，由于它的分子较小以及在缓冲液中的溶解度较大(大于500mM)，未作任何优化选作第一配体。在饱和量的乙酰羟胺存在下，用HSQC谱方法发现联苯及其类似物可以结合基质溶酶Kd在mM范围，经过近40余个联苯化合物的结构-活性研究比较，发现3'-氰甲基-4-羟基联苯(16)与基质溶酶的亲合力Kd达0.02mM。通过对乙酰羟胺，3'-氰甲基-4-羟基联苯类似物以及基质溶酶的三元配合物的NMR研究，设计合成了11个化合物(17～27)，生物活性实验证明，与原有单体化合物相比，所有化合物的活性均有增强。对基质溶酶最具抑制活性的化合物22和25其IC50分别为25和15nM，活性增强近千倍。当用传统酶抑制方法筛选了大约115000个化合物,没能发现一个非肽类抑制剂其活性IC50小于10mM；相反他们仅用了大约6个月的时间就获得了高活性的化合物，可见这种方法是相当成功的。
上述三个实例是非常成功的，给人的启示是深刻的。“SAR by NMR”方法的优点在于： (1)使用2D 15N/1H HSQC谱来检测结合于15N标记蛋白(酶)的小分子配体，由于15N谱的编辑功能观测不到来自配体的信号，因此即使在高浓度时也能检测到这种结合；(2)使用HSQC谱可以迅速检测到不同配体的不同结合部位，这对于阐明结构-活性关系以及指导配体连接化合物的合成是至关重要的。如果不能获得足够量的15N标记蛋白，则HSQC谱方法不再适用。新近作者又开发了两种不需要15N标记蛋白的新方法——一维驰豫编辑和扩散编辑NMR方法[20]，弥补了这种方法的不足。(3)“SAR by NMR”方法的优点还在于如从1000个化合物的库中筛选两个结合部位的先导配体相当于传统方法筛选1000×1000=1,000,000个化合物，这种方法相当快(如上述实例二的成功仅用6个月时间)，而传统方法要长得多。(4)两个配体可通过不同的连结子(linker)连接起来，这种连接还从焓变和熵变对结合能的贡献上得到了理论支持[21]。
“SAR by NMR”方法在概念上类似于组合化学，然而这两种方法有本质的区别，在组合化学中发现配体需要制备测试大量的化合物，不幸的是，合成方案的选择和生物测定往往既困难又费时，进而相对统一的条件需要限制了有用的分子构建模块及化合物的多样性。在“SAR by NMR”方法中，配体已预选进行了优化，所以只需合成少数几个化合物即可。另一方面“SAR by NMR”方法不同于组合化学，筛选小分子化合物的范围仅仅受到水溶解度达mM浓度的限制，结果可以收集到多种多样的化合物样品。“SAR by NMR”这种方法也受到一定的限制：(1)需要高场NMR谱仪(500MHz以上)；(2)大量的15N标记蛋白(200mg以上)；(3)靶标蛋白(酶)的分子量小于40KD；(4)靶标蛋白(酶)在水中的溶解度达0.2mmol.L-1浓度；(5)用于检测的小分子在水中的溶解度达mmol.L-1浓度。
总之，本文从两个方面介绍了核磁共振技术在构效关系研究中的应用。第一种13C NMR方法类同于传统的QSAR研究，对于新药分子设计是有益的，第二种方法是全新意义上的创新方法，相信随着人们对农药，医药的作用机制及靶标蛋白(酶)的三维结构的深入了解和相关功能的研究，利用这种方法会加速新农药、新医药的创制过程，这无疑对于即将进入21世纪的我国新药创制体系的形成和发展产生深远的影响。
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