NMR中的实验技术
1）样品准备（比较重要）人们往往把注意力集中在谱仪操作上，而忽视样品准备。作为样品提供者来说所关心的是得到一个信噪比好、分辩力高的谱图。所以，花几分钟把样品准备好，可以节省几小时的谱仪的时间，同样，处理好的纯样品可以得到可靠，准确的结构（分离手段的应用后纯度非常重要）信息。
2）溶剂选择
选择溶剂首先要考虑溶解性，对高场谱仪来说，能溶解几mg也就足够了，要避免溶剂峰遮盖谱峰，一般氧化试剂的氘化纯度在99.5%到99.99%，以上无论怎样纯总会出现一些未氘化的残留峰和杂质峰，尤其是溶剂中的H2O峰常常大于残留峰，如DMSO-d6，C5D5N等，要熟悉所用的氘化试剂可能出现的杂质峰对解析谱图十分重要图画出了常用氘化试剂的杂质峰。溶解度对观察线宽影响很大，Ή谱尤为突出，常用NMR溶剂分为粘性（苯，二甲基酰胺、二甲基亚砜、吡啶、甲苯和水）和非粘性溶剂（丙酮、乙晴、氯仿和甲烷等）。最高分辩只能在非粘性溶剂中获得。丙酮常被用做测试分辩率和线型的溶剂。常规NMR应用中，粘度问题不十分重要；含活泼氢溶剂妨碍样品中活泼氢观察，在无活泼氢有机溶剂中观察活泼氢，再用D2O交换确证；如用CDCL3检测2H，加D2O交换。高、低温实验要考虑溶剂的溶点，沸点以及温度与溶解性的依赖关系。常用高温溶剂有DMSO和DMF，常用低温溶剂是（CO3）2CO和（CD2）CL2，含芳香环溶剂，如苯和吡啶会引起化学位移观测值较大改变；最后一点，要考虑氘化试剂的价格，尽量选便宜的溶剂，D2O和CDCL3最便宜，C5D5N、 CD3OD和二氧六环最贵，从NMR观点，最受欢迎的溶剂是CDCL3。
3）样品管及样品用量
作为一般常观实验，无论是高场谱仪还是一般谱仪对测试样品管要求并不高（做大分子样品等例外），但样品管必需清洗干净、无残留溶剂和杂质，以免影响测试结果。
高场仪器对样品溶剂的体积要求很严格，要保证一定的体积主要是考虑样品的匀场和接收信号线形正常，另外，是送样量的要求，分了量在300~1000的样品，用样量5mg左右。测13C谱得加倍量。
4）样品的处理
要得到高分辩的谱图，溶液中绝不能有悬浮的灰尘和纤维。一般情况下用棉花和滤纸把样品直接过滤到样品管中。测试微量样品时，要带手套处理样品，以防手指上的微量物质溶在溶液中，否则Ή谱中1.4ppm会出现一个7Hz裂分的双峰，4ppm还有一个四重峰，可能来自丙氨酸或乳酸。
三、实验技术与方法的特点和选择
作为化学研究人员来说，当得到一个纯的化合物，首先需要知道其化学结构是什么？然后才能研究其它的一些实用价值，除了一些理化数据，IR,UV,MS和NMR是鉴定化合物结构最常用的方法。刚才讲到前几节课中已讲了NMR的解析，原理，这里主要是穿针引线的介绍一下各种NMR实验技术与方法的特点，解决问题和选择方法。
一）一维谱图
11H -谱
1H-谱是结构测定中应用最普遍的方法。根据谱图可提供：化学位移，偶合常数和积分值。从实验上看也很简单只有一个90°脉冲，经FT变换后得谱图。经过多年的集累分析，绝大多数类型的化合物都有1Ή谱的化学位移，归属数据和有关图谱库可查阅。
2、13C-谱
以单脉冲检测高频振荡的13C信号，对1H质子全去偶，得到碳谱。
优点：
a、信息量大，碳原子构成了有机化合物的骨架，掌握有关碳原子的信息在结构鉴定中有重要意义，从这一角度看，碳谱的重要性大于氢谱。例如：六取代苯环、乙烯四取代饱和碳原子的取代等，从氢谱上是不能得到直接信息的。
b、分辨力好。常见有机化合物氢谱的δ值很少超过10ppm，而碳谱的变化范围可超过200ppm，由于碳谱的化学位移变化范围比1Ή谱大十多倍，化合物结构上的细微变化可望在碳谱上得到反映。这是氢谱不能比的。
缺点为，灵敏度小。自然界中的碳元素大部分是自旋为零的12C（~98.9%），13C为1.1%，加上旋磁比只是1H的1/4。（核的NMR信号强度 式中Ho是外磁场，γ是旋磁比，N是共振核的数目，I是核自旋量子数，都等于1/2的13C与1H比较。13C总的观测灵敏度只有大约1H的1/6000，通常的实验条件下，若不进行长时间的累加测定13C谱至少需要数十毫克样品。但是随着谱仪的进步，灵敏度提高，用量减少，13C发挥越来越大的作用。
检测13C谱，通常记录的是质子去偶谱，把质子偶合引起的多重线合并为一条线，加上NOE效应可将灵敏度提高一个数量级，但丢失了所有C-H偶合信息，早期采用偏共振技术，利用残余的J偶合确定直接连在碳上质子的数目，即将碳分为-C-，CH，CH2，CH3四类，（门控去偶碳谱），但由于偏共振谱中偶合数分布不均匀，多重线变形和重叠等原因，研究复杂分子是行不通的。另外，为去除NOE效应带来的谱线增高，用反门控实验来检测13C谱、可以达到定量目的。
3、极化转移实验技术（INEPT，DEPT实验）
由以上提到的，门控去偶实验，由于1JCH较大保留高阶偶合（nJLR）而使谱线严重重叠，难以辩认；二维J谱和选择激发的方法有效地解决了这个问题，但灵敏度不高。80年代初发展了一种多脉冲实验，解决了以上问题。
在多脉冲实验的描述中，有两个基本概念：a、极化传递或相干传递；b、发展期
极化传递：在所研究的核自旋体系中大家知道，存在着偶极相互作用，J偶合作用和化学交换等。在液体中，最重要的是J偶合作用。通过这些相互作用实现磁化量的转多，不仅提高了灵敏度也可把各种信息区分开，或者得到一般NMR方法观测不到的物理量，如多量子跃迁等。
发展期：多脉冲实验的另一个特征是引入“发展期”（evolution Period），在发展期内，自旋体系受Hamilton量作用在一些脉冲作用下进行演化，演化前自旋体系处于特定状态，这个时期称做“预备期”，发展期后进行数据采集，称作“检测期”。
在多脉冲实验中，发展期可以改变检测期的初始状态，控制整个实验的信息量。
极化转移方法，顾名思义就是从氢核的自旋极化转移到另一核上（13C），由1H到13C的完全极化转移是将13C的α，β能态的粒子数差提高γH/γC三4倍，从而使信号强度增加4倍。
INEPT（Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Iransfer）采用异核极化转移技术，其基本脉冲序列为：
1H：90oX-τ-180o-τ-90oy
13C： -180o- -90oX-检测
见INEPT谱图
基本INEPT实验是差分传递，没有净传递，其谱线的反相特征势必影响重叠体的解释，若加上去偶后再观察，就得不到任何增强。
DEPT实验（Distortionless Enhancement by Polarization Transfer）
为了得到既提高灵敏度又使强度不畸变的谱，发展了一种巧妙的极化传递方法，称作DEPT方法。且脉冲序列比INEPT短。DEPT脉冲序列：
1H= 90oχ-T-180oχ-T-θ0χ-τ-
13C： -90o- -180o- -ACQ
DEPT序列简短克服了INEPT方法引起强度比和相位畸变的缺点，碳氢多重线具有正常的强度比和理想的相位。在发展期能明显减少由横向驰豫而损失的磁化量。利用光谱编辑法能得到区分CH，CH2和CH3信号做DEPT谱，但这样需要分别进行三次测试（即45o，90o，135o）。
4、NOE差谱和NOESY 1D谱
检测NOE谱在研究分子中核或基团空间排列的信息有着非常重要的地位。NOE是核的驰豫问题，是结构化学中一个很重要的物理现象。当以某种方式干扰一个跃迁谱线时，与此核有偶极一偶极作用的另一个核的跃迁谱线强度发生了变化，叫做NOE效应。它不取决于标量偶合是反映偶极间的直接磁性偶合作用。通过NOE的研究，人们可获得偶极一偶极偶合信息，最终与核间距分子运动和分子的立体结构关联。具体谱图的实现为；①作-’H谱 ②选择照射点；③选择对照点 ④用程序进行长时间累加。注意：样品的处理除气，过滤，保持仪器稳定性，匀场要好等。
用整形脉冲也可进行NOESY1D谱实验，灵敏度和选择性比NOE差谱好。
二）、二维谱图（2DNMR）
1971年Jeener提出了二维付里叶变换NMR新测定方法，当时这种方法未被理解，直到4年后才由Ernst等首次完成了二维FT-NMR实验。1976年Ernst等人将二维FT-NMR理论公式化，并指出了这种方法会得到广泛应用。现今为止，发展了许多二维FT-NMR方法，针对不同研究对象每年都有大量新脉冲序列程序发表。
所有2D NMR实验可用以下术语描述：
准备期（D1）-发展期（t1）-混合期（τm）-检测期（t2）
准备期是为了使磁化矢量达到适当的初始状态而设置的，接着在发展期控制磁化矢量的运动，然后在检测期检测信号，并反复循环累加，逐次改变t1增量，再反复累加，最后将所得数据S（t1 t2）对t1和t2进行FT变换，即可得到二维谱。
2D NMR谱基本可以分为两大类：
a、J-分解谱：发展期被π脉冲分裂开，或叫“回波序列”。化学位移（δ）在后半个发展期为进动，聚焦或有效翻转，而只保留J偶合的进动，其实验结果是FID仅仅受J偶合调制。F2域为δ信息，F1域为J偶合信息。
见图： 现一般不多用，除了进行J值的研究。
b、化学位移相关谱，发展期基本上用于与进动（常常同时伴有J偶合），混合期确定了要研究的相互作用的类型，即有相互作用（通过成键或空间）的自旋之间产生磁化转移，来完成整个实验。所有2D NMR都关连着一系列的正交检波，脉冲序列和有关参数设置，在这里就不多描述了。下面介绍一下常见二维谱的特点和解决问题。
1、H-H COSY（H-H correlation spectroscopy）
COSY谱是最重要的二维技术之一，由于发展早，也比较成熟，谱中二维座标都表示1H的化学位移。COSY谱图中有两类谱峰，一类为对角峰，这是那些在t1和t2期间具有相同频率的组分，第二脉冲期间没有进行磁化转移，对角线呈现出正常的AX系统-维谱，这类峰代表化学位移。另一类是交叉峰，又分为两类，靠近对角线的峰是同核多重峰的一部分，远离对角线的是具有共同偶合常数的不同种核的多重峰。
特点：很容易识别1H与1H的偶合关系。但得不到具体偶合常数。通常看到的是“对称”化操作谱，比较漂亮，要学会排除假峰。
2、L R COSY谱
脉冲序列同COSY，主要是在90o PW中引入D2的延迟时间，着重于远程偶合的检测，灵敏度小，有可能检测到4JH-H～5JH-H间的偶合（0.1～0.5Hz）。
3、相敏COSY（DQF COSY）
对复杂分子如三萜皂甙和多肽，多糖等化学结构的COSY谱，对角线峰相位与交叉峰正好相差90o，为色散线形，所以普通COSY分辩很差，无法细分比较密的1H-1H相关峰。最常采用的双量子沪波相敏COSY (DQF COSY)大大改进了相敏COSY谱，对角线峰和交叉峰均能调节到纯吸收形。双量子沪波在理论上，灵敏度降低二倍，t1噪音也较大，但通过温控和长时间累加，多肽，多糖的化学结构确定主要是靠DQF- COSY来完成。
4、TOCSY（Total correlation spectroscopy）或HOHAHA（Homonuclear Hartmann-Hahn）和RDESY实验(Rotating-frame nutlear Overhauser Effect Spectroscopy）
TOCSY是运用自旋锁定的方法，将同一自旋系统中的所有氢均关联，可以逐步增加自旋锁定时间，使自旋系统中的各个1H依次相关，达到推定结构的目的。有些象接力COSY谱。
把COSY序列中第二脉冲和NOESY序列最后两个脉冲，包括混合时间，用一个长射频脉冲取代。
90o
（Ф+β）
在这种条件下，不存在化学位移差，即一个AMX自旋系统简化成AA’A”自旋系统，因为强偶合存在，通过标量偶合的磁化转移非常容易发生，这种“混合”是由强射频场实现的，导致了全部相关。
COSY和TOCSY谱比较
（1）COSY交叉峰中主动偶合的磁化矢量是反相组分，小J偶合信息可能被抵消，而TOCSY实验的主动偶合是同相组分，提高了小J偶合的检测灵敏度。
（2）TOCSY谱的特征是提供COSY和同核接力相干转移信息，接力转移信息，接力转移步数由自旋锁定混合脉冲长度控制，因此，可以不同的τm参数得到不同偶合相关信息，在2D谱线横截面等高图上可以观察到一个完整的自旋体系，简化谱线归属。
NOESY和ROESY的区别：
ROESY是旋转坐标系的NOESY谱，都提供通过空间作用的核自旋相关信息，但两者有区别：
（1）NOESY和ROESY的交叉峰都取决于相关自旋间存在交叉驰豫，但NOE是纵向交叉驰豫（Longitudinal cross relaxation）nn 而ROE是横向交叉驰豫（trasbverse cross relaxation）。
（2）检测灵敏度的差异。NOE和ROE交叉峰强与对角线峰强比值与相关时间τm有关。NOESY交叉峰在分子量大和小两个极端，灵敏度很大。而ROESY交叉峰在不同分子量的分子中变化不大。
（3）NOESY相关峰为反相组分，而ROESY相关峰为同相组分，可以检测小的相互作用。
5、C-H HETCOR （Heteronuclear correlation Spectroscopy）和HMQC（heteronuclear multiple quantum correlation spectroscopy）实验。
是基本异核位移相关实验，同COSY图谱一样，很重要，在解决结构问题时，首先要考虑的实验。
C-H相关谱能提供C与H的化学位移相关信息（1JC-H）在做C-H相关谱时，首先考虑1H，13C谱数据，不能解决问题时再考虑做C-H相关谱。缺点是灵敏度太低。
传统的异核相关谱都是激发13C核观察同1H核的关系，由于13C灵敏度低，要求样品量大，特别是远程相关谱有各种因素的干扰，难以取得满意的结果。80年代末发展了1H检测的异核相关谱，又称反转实验（Reverse或Inverse）质子的极化转移使异核位移相关实验比常规的异核F1观察灵敏得多。见比较图。
实现此种实验需要硬件和软件的支持，如a、反相探头，1H线圈在内，13C线圈在外，b、沪波器，c、软件、反转极化转板脉冲序列，当前的谱仪都可以做到。
Inverse实验是通过极化转移和多量子沪波通过1H检测间接地得到X核与1H的关联，它最突出的优点是灵敏度高，但也有列外，如对一些质子峰强度差太大的化合物就不实用。
6、COLOC谱和HMBC实验（correlation Via long-range couplings and heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy）
远程化学位移相关谱提供两健或大于两键的C-H偶合信息。是建立C-C间关联，甚至跃过氧，氮或其它原子的官能团关联的有效方法。成为推导结构，归属同碳质子，确定1H取向等立体结构分析以及解决那些由屏敝效应难以解释的季碳归属问题的强有力工具。同C-H相关一样，COLOC的缺点是：①1JC_H峰得不到有效的压制；②灵敏度通常用样量20～30mg，累加14-18小时。HMBC实验可以完全解决以上缺点。现在已经淘汰了COLOC实验方法。
四、实验技术的新进展
1、谱仪向高场发展
核磁谱仪场强的不断升高，从某种程度上增加了NMR的灵敏度和分辩力。如每隔几年都有很大的变化87年有了600兆，90年～91年700兆，94年有了第一台750兆，98年800兆，2000年10月第一台900兆获得NMR谱图。
2、实验方法的最新进展
由谱仪硬件的发展，用多通道谱仪可以成功的实现三维谱和C、H、N相关谱，使研究大分子的分子量做到10万以上。如感兴趣可以查一下文献。
3、探头的改进
探头线圈材料的改进提高了测试样品的灵敏度，如反式H-X多核探头，十多年前1H的信噪比为450：1，而现在的信噪比可达850：1以上，几乎提高了一倍，从提高灵敏度设计思想，近几年来的Nano探头和超低温探头发展最快。
1）魔角MAS梯度gHX Nano探头
魔角旋转微量检测技术是几年前才问世的一种微量样品检测新方法。设计人员通过计算表明，当很小体积的样品处于魔角旋转情况下，由磁化率的不匹配所引起的非旋转线加宽将达到1.5KHz左右，这就意味着样品的旋转速率必须大于1.5KHz，才能使谱线窄化，并使边带得到有效抑制。根据这些结果，设计人员成功地设计出一种新型超微量探头-Nano微量探头。
Nano探头是一种性能很好的超微量探头，窄腔Nano样品转速一般在1.5～3.0KHZ之间。目前使用的Nano超微量探头可以将很小体积的样品（不超过40μl）全部集中于探头内接收线圈的有效范围内，并且运用高速魔角旋转技术消除谱线加宽，确保小体积样品保持均匀的磁化率和高填充因子，以得到最高的灵敏度和最佳的线形，这是以前微量技术难以达到的。灵敏度比一般探头高2-4倍。见实例。国内已有多家实验室配备了此种探头。
2）超低温探头
利用高温超导薄膜材料而制成的超导低温探头，当样品温度由温控单元维持时，采用闭环或开环制冷系统使超导线圈冷到25K，消除了谱图的电噪声，提高了检测灵敏度。是常规探头的四倍。相对常规5mm探头而言，其潜在灵敏度可以提高8～10倍。国内已有此类探头使用，500兆信噪比可达到3200：1。可达到800兆水平。
4、LC-NMR联用技术及其应用
核磁共振波谱是当今应用于溶液、固态及晶体分子结构分析的最为有效的方法之一。混合物的结构测定通常需要预先将混合物分离成较纯的单体，然后再测试每个组分的谱学数据。这样就会遇到诸多的问题，比如样品处理时间太长，分离所得到的样品量太少以及普通制备用的分离手段达不到分离要求或分离中易变物质，使NMR的应用受到一定的限制。而HPLC则是分离复杂混合物最为有效的工具。基于这种考虑，如果把HPLC和NMR成功联用，就会为复杂混合物成分鉴定提供一种新的快速有效的方法。LC-NMR联用是把HPLC的分离能力和NMR提供最大量结构信息的能力结合起来达到鉴定化合物结构的目的。这也是LC-NMR近几年得到快速发展的原因之一。LC-NMR技术已在许多领域中得到应用。其硬件和软件已商品化，技术日臻完善。
1）、LC-NMR发展概况
HPLC和NMR联用技术的研究开始于70年代末，但是这种构想在当时没有得到充分的发挥，主要有以下几方面的限制：
①、NMR谱仪灵敏度低；
②、HPLC流动相溶剂峰压制效果差；
③、流动检测池和探头没有商品化。
随着技术的不断发展，存在的这些障碍逐渐得到克服和解决，LC-NMR联用技术已取得了很大的突破，进入90年代后，由于高场谱仪的应用，已为LC-NMR联用发展提供了有力的技术。使之在药物化学、药物代谢、组合化学等领域有很突出的表现。
2）、LC-NMR联用系统结构
①、LC-NMR系统
用于HPLC控制的计算机、进样器、泵、柱子和检测器、LC-NMR探头、流动液池、NMR谱仪。
②、LC-NMR配套技术
整形脉冲、脉冲梯度场（整形脉冲压溶剂峰、NMR梯度实验，梯度匀场）数字沪波和自动化软件，大容量工作站等。
3）、LC-NMR的操作模式和技术
到目前，应用LC-NMR检测有五种模式：
连续流动，停止流动，分时止流，收集分析和选择UV检测激发NMR采样的自动检测。
连续流动：一般只适用于1H和19F测试。在洗脱过程中，溶剂组成不断变化，给峰压制造成一定的困难。一般先采用预实验，将不同时间山峰情况记录好，有一定的分离条件后，再测一些感兴趣峰的NMR谱。
停止流动模式：
即使溶液停留于检测池中进行测试，当所需要组分的保留时间已知，或者HPLC-NMR采用灵敏的在线检测器时，可以采用这种方法。在停止流动的模式下，检测NMR1H谱或二维谱。
收集分析：色谱洗脱峰被预先收集到每个样品池中样品收集品，然后进行离线的NMR检测。
分时止流：按一定的时间间隔暂停流动相来检测NMR谱。这种方法在被检组分没有UV发色团时尤其适用。通过HPLC-NMR谱，也可以估计色谱峰的纯度。
紫外激发：这种方法主要是利用软件技术，在UV检测到组分峰时，经过计算将样品组与准确地滞留于检测池中，并通知NMR进行采样。
LC-NMR联用技术主要有以下应用
①、在药物代谢研究中的应用；分析代谢产物，目前应用最多。
②、天然产物化学中的作用：在线或收集分析鉴定合物结构。
③、食品化学：鉴别食品中有关成份，作为质量控制，品质评定。
④、高聚物分析：在大分子化学中，NMR是最有力的鉴别接序和结构的工具。
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