高效毛细管电泳在中药含量测定中的应用
高效毛细管电泳法( high performance cap illary electrophoresis, HPCE) 是指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离管道, 依据样品中之间高度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术, 具有分离效率高, 分析速度快,样品用量少等优点。李红、汤树良[ 1, 2 ]通过文献、资料中的实验及大量临床研究进行分析, 并以中药学为例进行阐述,显示HPCE具有“三高两少一广”的优点。HPCE已经成为近年来发展最为迅速的分析技术之一, 广泛应用于各种药效成分及中药材中主要成分分析。陈静、刘华红等[ 3, 4 ]认为HPCE作为一种新型快速高效的分离分析手段, 具有广阔的应用前景。自1990年HPCE法首次用于熊果酸中熊果苷等化学成分的分离与测定以来, HPCE法在中药化学成分分析中的应用得到了迅速开展, 对中药现代化起到了推动作用[ 5 ]。笔者主要对HPCE法的几种类型及其在中药成分分析中的应用进行概括, 以供参考。
1 HPCE 的沿革、原理及分离模式
1. 1 HPCE 的沿革
电泳法的理论可以追溯至1897 年, 由Kohlrausch 提出离子迁移方程;1930 年, Tiselius 发表“自由界面法研究蛋白质电泳”研究论文,创立了自由界面电泳技术,此后电泳技术在生物科学中得到较大发展;1967 年Hejerten 提出应用毛细管代替凝胶板,发展成为自由溶液HPCE 技术,但实用性差;1974 年Virtanen 阐述了应用较小内径的毛细管柱的优点;1979 年Mikkers 等用等速电泳在200μm内径的毛细管上分离有机和无机离子;1981 年Jorgenson 和Lukacs 发表的研究论文对CE 发展做出了决定性的贡献,他们用内径75μm 的毛细管对荧光标识氨基酸化合物进行CE 测定,获得理论塔板数高达40 万的高分离性能,并且深入地阐明了CE的一些基本性能和分离的理论依据,使得对HPCE的高效分离能力成为共识; 1984 年Terabe 等人提出了胶束电动毛细管色谱法,使许多电中性化合物的分离成为可能,大大拓宽了CE 的应用范围;1985年,Hjerten 将传统的等电聚焦电泳方法引入毛细电管内进行分离, 提出了毛细管等电聚焦( capillaryisoelect ric focusing ,CIEF) ,使CIEF 技术在蛋白质分离中成为一个强有力的微柱分离分析工具,达到能分辨等电点仅相差0. 01pH 的高分辨水平; 1987年,Cohen 和Karger 在Hjerter 等人前期工作的基础上发表了毛细管凝胶电泳(capillary gel elect rophoresis ,CGE) 的研究成果,实现了蛋白质碎片的CGE 分离;1988 年以后,HPCE 商品仪器的问世及高灵敏度柱上检测器的发展,使高效毛细管研究在世界范围内蓬勃开展,促进了HPCE 技术和理论的迅猛发展。
1. 2 HPCE 仪器的组成及基本原理
HPCE 仪结构组成很简单,包括0～30 kV 可调稳压稳流电源,内径小于100 μm、长度为30～100cm 的毛细管,检测器,为电泳提供工作介质的缓冲液池,与检测器相连的数据采集及处理系统5 部分,其中毛细管柱是分离的核心部分。HPCE 具有色谱和电泳两种分离机理,是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术。
２ 分类
２． １ 毛细管自由区带电泳法(CIE)
CIE是毛细管电泳中最广泛的一种技术, 它是通过在充满具有一定缓冲能力的电解质溶液的毛细管中, 依靠样品中不同荷质比大小的组分在外加电场的作用下迁移速度的不同而实现分离。在CIE法中, 缓冲液的pH值是影响组分离子滴度的最主要的因素, 对于具有较宽范围的酸解常数Pka的样品, 很难找到一个合适的缓冲液体系使组分完全分离且出峰时间较短。Terabe等[ 6 ]通过在缓冲液中加入添加剂与样品组分形成络合物, 引入化学平衡的方法来改变具有相似Pka值样品组分的电泳滴度, 可获得较好的分离效果。此外, 在一定电压范围内, 迁移速度与电压之间存在线性关系, 当电压过高时, 由于产生了焦尔热, 而使线性关系发生偏移。但迁移速度与电流之间有很好的线性关系, 即使在高压情况下, 也有很好的线性, 如薄涛[ 7 ]等分离山酮类化合物就是利用电泳迁移做定量研究。
２．２ 毛细管凝胶电泳法(CGE)
CGE法是分离效率最高的一种毛细管电泳模式, 主要由于毛细管内填充中凝胶,而凝胶黏度大, 抗对流, 能减少溶质的扩散, 因此能限制谱带的展度, 所得的峰形尖锐, 柱效极高, 并且溶质和凝胶(或加在凝胶基质中的添加剂) 生成络合物, 又能使分离度增加, 同时凝胶又可防止溶质在毛细管壁的吸附并减少电渗流。此外, CGE的样品容量为1012g, 用于定量, 可以实现自动化, 也可用于大分子物质的微制备和馏分收集。但是, CGE的柱制备较困难, 且寿命较短。有人采用黏度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺, 可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分介质, 它能避免空泡形成,比凝胶柱制备简单, 寿命长, 但分离能力比凝胶柱略差。
２．３ 毛细管导电聚集电泳法(CIEF)
CIEF是依据样品组分(主要是两性化合物) 等电点不同而实现分离; 毛细管的等电聚焦是将一种两性电介质的混合物作为载体注入毛细管中产生pH值梯度, 使有不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上, 不作迁移而彼此分离。CIEF具有极高的分辨率, 通常可以分离等电点差值小于0101pH值单位的两种蛋白质。在毛细管电泳中, 如果缓冲液的pH高于硅胶
表面的Pka值, 则会在带电的硅胶表面形成一个双电层并导致电渗。在CIEF中, 电渗流碱环境稳定的聚焦区带, 目前多采用将亲水性聚合物键合到毛细管管壁表面来减少电渗流, 同时还能除去管壁上可能造成蛋白质吸附的活性点。
２．４ 毛细管胶束电动色谱法(MECC)
MECC是根据分子在胶束中的保留时间不同来进行分离的。通常, 由于胶束的静电排斥作用, 阴离子在缓冲液相的停留时间最短,阴离子电荷越大, 流出越快; 中性分子的分离是以疏水性为基础, 流出速度较阴离子慢; 阳离子则受到胶束的静电吸引作用的影响, 电荷越大, 保留时间越长。但是如果溶质的疏水作用很强, 则往往能克服静电排斥或吸引的影响,
另外电迁移有时也会影响流动次序。沈江姗等[ 8 ]在MECC中使用二元环糊精体系拆分CB I2氨基酸对映体, 在实验选定的条件下, 两者均能达到完全手性拆分。
２．５ 毛细管等速电泳色谱法(CITP)
毛细管等速电泳是一种较早的模式, 分离机理也是依据样品组分电泳淌度的不同来进行分离。它使用两种电解质, 一种为前导电解质, 含有比所有样品组分电泳淌度都大的前导离子; 另一种为尾随电解质, 含有比所有样品组分电泳淌度都小的尾随离子, 样品组分加在两种电解质的界面。施加电压后, 样品组分夹在前导离子和尾随离子之间移动, 并逐步分离。当达到电泳稳定时, 各组分按其电泳淌度的大小依次相连,并都以与前导离子相同的速度移动。
２．６毛细管电色谱法(CEC)
毛细管电色谱法是主要基于色谱分离机制进行分离的电泳技术, 它在毛细管中填充了液相色谱用的固定相载体, 使被分离组分在这些固定相载体上进行保留和分配, 它与液相色谱技术的区别之处在于前者是以电渗力为驱动力, 而后者是以压力为驱动力。
３ 在中药含量测定中的应用
３．１ 中药有效成分研究
HPCE 法日益广泛地应用于中药有效成分的分离和含量测定,分析成分包括生物碱、黄酮类、苷类、有机酸类、醌类、酚类、香豆素类等。
３．１．１ 生物碱类
朱萱萱等[9]根据生物碱类解离带上正电荷,采用CZE 法建立了测定麻黄中6 种生物碱:麻黄碱、伪麻黄碱、去甲麻黄碱、去甲伪麻黄碱、甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱; Hermanh 等采用CZE 法对钩藤属植物Uncariatomentosa 中6 种羟基吲哚类生物碱进行了分离分析; 台湾LiuYing Mei等采用CZE 法成功地分析了黄连中的八种季胺生物碱,它们是黄连碱、小檗碱、表小檗碱、棕榈碱、非洲防己碱、小檗亭碱、药根碱和木兰花碱。Liu 等改用50μm 的毛细管柱,采用CZE 法测定了黄柏中6种季胺类生物碱,即小檗碱、棕榈碱、药根碱、木兰碱、黄柏碱、小檗红碱;林梅等分离了4 种莨菪类生物碱:阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、樟柳碱,并考察了在磷酸缓冲液中加入不同有机溶剂对分离选择性的影响;纪秀红等采用CZE 法以马钱子碱为内标,对10 种十大功劳属植物的小檗碱、巴马亭、药根碱的含量进行测定; 余北楼等采用CZE、MECC 相结合方法将鸦片中海洛因、吗啡、罂粟碱、可待因及非法走私鸦片制品中单一酰吗啡、咖啡因、乙酸可待因和可卡因8 种毒性成分成功分离; 赵霞等采用CZE法,以心得安为内标,测定贝母中浙贝母乙素、西贝素、西贝苦等生物碱的含量; 姜舜尧[10] 等采用HPCE ,以多潘立酮为内标,甲醇20. 6 mol/ L TriS 溶液(1∶1) pH 6. 0 ,其中含10 mmol/ L 庚烷磺酸钠,电压20 kV ,检测波长200 nm ,对夏天无药材中的成分进行了分离研究,分析了原阿片碱和延胡索乙素的适宜分离条件,并测定了其中延胡索乙素的含量;李顺祥等采用HPCE ,以0. 02 mol/ L 磷酸缓冲液(pH 7. 0) ,检测波长201 nm ,操作电压20 kV ,用外标峰面积法测定苦参中生物碱含量;周洪雷等采用HPCE ,以0. 05 mol/ L 四硼酸钠(pH 7. 0)2甲醇(85∶15) 为缓冲液,检测波长254 nm ,操作电压14 kV ,真空进样测定黄连生物碱的含量,并考察黄连与肉桂配伍前后黄连主要生物碱含量; 罗明等采用HPCE ,以20 mmol/ L 磷酸盐缓冲液(pH 8. 0) ,操作电压30 kV ,检测波长214 nm ,氨茶碱为内标测定了中药苦参及广豆根等中主要有效成分苦参碱、氧化苦参碱含量;乔梁等采用HPCE 以马钱子碱为内标物, 0. 05 mol/ L 四硼酸钠(pH 7. 0)2甲醇( 85 ∶15) ,电压14 kV ,检测波长254 nm ,真空进样,测定黄连及黄连配伍阿胶药对中的黄连生物碱含量;李琴韵等[11]采用HP3D 全自动HPCE 在254 nm 以20 mmol/ L 硼砂溶液为缓冲液(pH 9. 18) ,电压30kV ,对药典收载的3 个品种的14 个吴茱萸样品(不同产地) 中所含吴茱萸碱进行含量测定。
３．１．２ 苷类
岩上等[12]采用MECC 分离人参中的人参皂苷Rb1 、Rg1 、Re 等7 种皂苷;杨瑛等采用
MECC ,以苯甲酸钠为内标,测定芸香科相橘属药材中柚皮苷及橙皮苷含量;黄华艺等[13]CZE 分离模式分析从芒果树叶中提取的芒果苷; Honda 等采用CZE 测定了芍药根中芍药苷、氧化芍药苷的含量;Kenndler 等采用CZE 测定熊果叶中熊果苷的含量;周丽芳等采用HPCE ,以20 mmol/ L 硼砂含20 %乙腈为缓冲液,电压25 kV ,检测波长254 nm ,测定淫羊藿中淫羊藿苷的含量; 李绍平等采用HPCE 以0. 2 mol/ L 硼酸为缓冲液(pH 8. 5) ,电压20 kV ,检测波长254 nm 测定天然和人工冬虫夏草中腺苷、鸟苷、尿苷等核苷类物质含量; 陈勇川等采用
HPCE ,以50 mmol/ L 硼砂为缓冲液(pH 10. 6) ,电压20 kV ,检测波长230 nm 测定了芍药及成药中芍药苷含量。
３．１．３ 蒽醌类
宗玉英等[14]用MECC 测定了唐古特大黄、掌叶大黄和藏边大黄中的大黄素、芦荟大黄素和大黄酸的含量;张国庆等采用加有机溶剂的MECC ,分离模拟混合的何首乌中7 种蒽醌类成分(大黄素苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚苷、大黄酚和大黄素甲醚) 。
３．１．４ 有机酸类
沈红梅等[15]采用CITP 成功分离了乌梅中的柠檬酸和苹果酸,并对不同采收期乌梅中柠檬酸和苹果酸的含量进行了动态分析;范国荣等[16]选择CZE 分离模式,以肉桂酸为内标分离测定四倍体板蓝根药材中抗内毒素活性成分5 种有机酸成分的含量,并与二倍体板蓝根相比较,以考察四倍体板蓝根药材的优良品质;陈勇等采用CZE ,以硝基苯甲酸为内标对川芎中川芎嗪和阿魏酸进行了分离分析; 刘海兴等采用HPCE ,以10 mmol/ LSDS ,5 %乙醇的电解质溶液为缓冲液,电压16 kV ,检测波长214 nm 测定了石楠叶中齐墩果酸和熊果酸异构体的含量;丁岗等采用HPCE ,以20 mmol/ L磷酸氢二钠与60 mmol/ L 硼酸为缓冲液,电压24kV ,检测波长280 nm ,真空进样,对不同来源的诃子及其易混淆品中的可水解丹宁、诃子酸、诃黎勒酸进行定量分析;陈缵光等[17]采用反向HPCE 中反向CZE 分离测定了当归中阿魏酸的含量。
３．１．５ 黄酮类
Pietta 等[18]采用MECC 对银杏和山金车中的黄酮类成分进行了分离。
３． １．６ 其它类
芮建中等[19]采用CZE 法分离有机阴离子类中药成分丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸;李蓓等[20]采用MECC 法测定了金缕梅科枫香树属植物苏合香和枫香脂中总桂皮酸含量;朱晓琳等[21]采用HPCE 法,以苯甲酸为内标,0. 05 mol/ L 硼砂与1 mg/ mL 磷酸二氢钾(3∶62) 为缓冲液,电压20kV ,检测波长200 nm 对西洋参提取、纯化并测定了西洋参多糖含量;宋秀荣等采用HPCE 法,以0. 01mol/ L 磷酸盐与0. 02 mol/ L 硼砂(pH 8. 60) ,电压20 kV ,检测波长254 nm ,测定了桑叶中的有效成分槲斗皮素、紫槲斗皮苷、绿原酸。
３．２ 中药复方制剂化学成分分析
３．２．１ 片剂
李琴韵等[22]采用CZE 法测定小青龙片中君药麻黄中麻黄碱和伪麻黄碱的含量;林梅
等选择CZE 法,以麻黄素为内标建立了测定阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱等莨菪类生物碱的分析方法,并对颠茄片和颠茄酊剂中相应成分进行了定量测定;李发美等采用CZE 法,以苯巴妥为内标物,测定中药复方制剂喘咳宁片中的盐酸麻黄碱、巴比妥的含量;孙立华等[23]采用HPCE ,以双氯灭痛为内标物,测定葛根(野葛、粉葛) 及其制剂脑得生片中葛根素的含量。
３．２．２ 胶囊剂
陈勇川等[24]采用HPCE 法选择主药麻黄中麻黄碱和伪麻黄碱为指标,测定中药复方制剂麻附胶囊中麻黄碱和伪麻黄碱的含量; 张珂等[25]用CZE 法测定脑得生胶囊中葛根素的含量;姜舜尧等采用CZE 法对中药复方制剂伸筋丹胶囊中的士的宁和马钱子碱成分进行分离并测定了含量。
３．２．３ 注射剂
许平波等[26]使用HPCE ,以氨茶碱为内标,测定川芎注射液中川芎嗪含量。施军霞等采用HPCE ,以氨茶碱为内标,测定甘草注射液中甘草酸含量。芮建中等[27]采用CZE 法快速分离和测定丹参注射液中丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸的含量。
３．２．４ 丸剂
张国华等[28]采用CZE 法首先分离了黄连中黄连碱、小檗碱、表小檗碱、棕榈碱、非洲防己碱、小檗亭碱、药根碱,并进一步对含有黄连的六种中成药(香连丸、二妙丸、白带丸、牛黄上清丸、黄连上清丸及朱砂安神丸) 中的小檗亭碱、棕榈碱及药根碱进行定量分析。
３．２．５ 冲剂
岩上等[29]采用MECC 法对葛根汤等6 种中药冲剂中的甘草皂苷进行定量分析,此外还采用同法对加味逍遥散中的甘草皂苷和芍药苷同时定量,并对柴胡桂枝汤、小青龙汤中的甘草皂苷和芍药苷进行含量测定。
３．２．６ 栓剂
许重远等[30]采用HPCE 对中药复方制剂甘草栓中甘草酸含量测定。
３．２．７ 其它剂型
台湾LiuYing Mei 等[31] 采用CZE 法对23 种含黄连或黄柏的中成药中黄连碱、小檗碱和棕榈碱进行分离分析; 张艳等[32] 采用MECC ,以对氨基苯磺酸为内标,测定中药复方制剂瞿黄液中大黄素、大黄酚、大黄酸和大黄素甲醚的含量。王桂芳等[33]采用HPCE 同时测定苦参药材及其复方制剂夜夜安洗液中3 种生物碱槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱的含量。
４ 小结
HPCE 作为最新发展的一种色谱技术,比现今在药物分析中被广泛应用的HPLC 具有柱效高,分析速度快, 进样体积小, 易清洗等优点, 而且HPCE 更适合于直接分析水溶液及未经纯化的样品,不需要消耗大量的高纯有机试剂,节约了运行费用。在2000 版药典中已收录该方法。但适合HPCE 的实用检测器种类较少,常用的紫外检测器灵敏度较低,进样的定量精密度较差且毛细管末段堵塞会导致进样失败,这些缺点限制了现今HPCE在药物分析领域的应用,随着该技术的进一步发展,相信在不久以后HPCE 将和HPLC 一样成为应用最广泛的色谱技术之一。
页:
[1]
