免费下载 2006 年863课题
[hide]3.1课题简介（简要说明课题的目的意义、主要研究内容、预期目标等。字数要求1500字以内）在世界范围内，由动脉粥样硬化（AS）所导致的冠心病已成为人群最主要的死亡原因。然而，目前冠心病的临床预测主要依据美国费明翰计分，但其依据是冠心病危险因素的数量和强度，因而并非早期预测；目前冠心病的临床分型主要依据患者临床表现和实验室检查，这种分型方法只是针对晚期防御而非早期预警；目前冠心病的药物治疗主要依据临床试验的结果，但由于无法预测哪些患者服药显效、低效或无效，临床上全部患者服药只能达到使少数患者避免心血管病事件的目的，这既造成了较多的药物副作用又导致了严重的资源浪费。
为了解决这些冠心病研究中存在的重大问题，探讨冠心病早期预警、分子分型和个体治疗的新技术和新方法，本课题组拟在北京、上海、济南、武汉、广州、成都和西安等7个城市的8大医疗机构，构建心血管疾病资源收集、保存和利用共享平台和临床多中心协作网络，按统一要求收集和保存3500例冠心病和3500例正常人的临床资料及血液、组织和DNA标本，建立冠状动脉粥样硬化的标本库和数据库；综合利用全基因组基因SNP和重要候选基因SNP关联分析方法，并与功能研究相结合的多阶段多层次的研究策略，发现与我国冠状动脉粥样硬化发病危险显著关联的等位基因，分析基因－基因和基因－环境交互作用；在每个包括500例冠心病和500例对照者的人群共三个人群3000例受试者中进行3个层次的筛选，确定可用于冠状动脉粥样硬化早期诊断的SNPs位点，研制基因芯片；通过对冠状动脉粥样硬化发生、发展过程中的分子表型分析，发现早期诊断分子标记物；对重要候选基因和强关联SNP进行功能分析，发现新的药物靶点和生物标记物；在2000例冠心病和2000例对照者中检验SNP芯片诊断冠心病的准确性；在2000例具有冠心病高危因素的患者和2000例对照者中进行临床和冠状动脉64排CT的长期随访，对比SNP芯片和费明翰计分两种方法预测冠心病的准确性；选择冠心病治疗的4种主要药物—辛伐他汀、阿司匹林、培哚普利和美托洛尔，在每组300例共4组1200例冠心病患者中分析这些药物代谢、转运和作用靶点的SNP，在此基础上研制个体化药物治疗基因型诊断芯片；在2000例冠心病患者中验证个体化药物治疗基因型诊断芯片的准确性。
本课题的预期目标包括：（1）提供开放共享的冠状动脉粥样硬化多中心共享平台，建立覆盖7省市的冠心病基础和临床研究网络；（2）获得一批自主知识产权的易感基因，进一步揭示冠状动脉粥样硬化的分子机制，初步达到冠心病的早期预测、早期预防、早期诊断和早期治疗；（3）完成冠状动脉粥样硬化的全基因组关联分析，发现易感基因并阐明其信号传导通路；（4）研制可用于冠状动脉粥样硬化分子分型和危险度评估的生物芯片和诊断试剂盒；（5）研制个体化药物治疗基因型诊断芯片，提出并推广中国人群冠状动脉粥样硬化个体化治疗方案。这些目标的实现，对于降低冠心病的发病率和死亡率，提高人民健康水平，促进国家经济发展和建设我国和谐社会、具有重大的现实意义和深远的战略影响。
3.2课题主要研究技术的国内外发展现状与趋势，课题主要研究技术国内外专利申请和授权情况
一、国内外发展现状和趋势
（一）心血管疾病的全球威胁
进入本世纪以来，心血管疾病已成为是危害人类健康的全球性疾病。根据WHO 2003年的统计资料，心血管病已成为全世界第一位死亡原因，年死亡人数达1660万，占全球各种死因的1/3，其中720万人死于冠心病，550万人死于脑血管病。在过去30年中全世界由于心血管疾病导致的死亡增加了60％。据美国2003年的统计资料，美国1,800万人患心血管疾病，平均每天2,600人死于心血管病，平均每34秒死亡1人，心血管病死亡已占美国总死亡人数的38.5%。根据2003年中国卫生事业发展情况统计公报，心血管病已成为我国城乡居民第一位死亡原因，心血管病死亡已占总死亡人数的23%。2003年我国190万人死于心血管疾病，其中心脏病死亡68.4万，脑卒中死亡121.6万，平均每天5,200人死于心血管病，每16秒死亡1人，这一死亡速度是美国人心血管病死亡速度的2倍！心血管疾病的高发病率和高死亡率，已成为制约我国社会和经济发展的重要因素，我国2002年卫生总费用达5684.6亿元，比2001年增加658.7亿元（年度增长13%），用于心血管病防治费用每年已逾千亿元。
（二）动脉粥样硬化的病理学研究进展
动脉粥样硬化（AS）是以进行性脂质沉积、纤维组织增生和炎性细胞浸润为特征的累及全身大、中型弹性和肌性动脉的慢性疾病。病理学研究证明，主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉和下肢动脉是AS的易患部位。因此，AS是导致腹主动脉瘤、冠心病、脑梗死、肾血管性高血压和间歇性跛行的共同病理学基础，其中冠状动脉粥样硬化是AS致死的最主要原因，因而成为全世界心血管基础和临床研究的热点。1995年，美国心脏病协会首次将AS的病理学改变分为6种基本类型：I型：初始病变，仅在镜下可见动脉内膜下散在的来源于巨噬细胞源的泡沫细胞，常见于婴儿和儿童；II型：脂质条纹，是肉眼可见的最早病变，镜下可见聚集的泡沫细胞和散在的细胞外脂滴，常见于儿童；III型：粥样瘤前期，镜下细胞外脂滴聚集形成脂池，常见于青中年人；IV型：粥样瘤，脂池汇聚成脂核，覆盖以纤维帽，构成AS斑块，常见于中年人；V型：纤维粥样瘤，纤维帽增厚，新生血管增多，斑块增大，常见于中老年人；VI型：复杂病变，斑块表面破裂，出现斑块内出血或表面血栓形成，常见于中老年人。近年研究发现，尽管人类的AS病变持续终生，但却是一个稳定期和不稳定期交替出现的非线性发展过程，这一过程取决于斑块的稳定程度, 稳定性斑块可不产生任何症状或仅有劳力性缺血症状, 而不稳定斑块可导致猝死、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛和缺血性脑卒中。最常见的不稳定斑块称为薄帽纤维粥样瘤（Thin-cap Fibroatheroma，TCFA）。
（三）动脉粥样硬化的发病机制研究进展
由于AS是一种涉及多种病因和多种生理、生化和病理变化的慢性复杂性疾病，确切的病因和发病机制仍未完全阐明。然而，近年来随着分子生物学技术和动物模型研究的快速发展，人们对于AS的认识不断深化。已知AS的发生和发展涉及以下几个重要环节：（1）内皮细胞功能异常：这是AS发生的始动环节。在多种AS危险因素的作用下，血管内皮功能出现异常，内皮通透性增加，血浆低密度脂蛋白进入并沉积在血管内膜；（2）炎症反应：在内皮细胞分泌的趋化和黏附因子的作用下，管腔中的单核细胞、淋巴细胞、肥大细胞黏附并进入管壁，单核细胞增殖并分化成巨噬细胞；（3）氧化应激：在多种氧化性反应产物(reactive oxygen species，ROS)的作用下，进入内膜的低密度脂蛋白（LDL）被氧化为具有致AS最强作用的氧化性低密度脂蛋白（ox-LDL），巨噬细胞吞噬ox-LDL后形成泡沫细胞，后者死亡后释放脂质形成坏死核；（4）细胞增殖和凋亡；在炎性因子的刺激下，平滑肌细胞增殖并游移至内皮下，分泌胶原形成纤维帽。在血流动力学触发因素和活动性炎症作用下，平滑肌细胞产生凋亡，纤维帽变薄和破裂；（5）血小板激活和凝血反应：斑块破裂后可激活血小板和组织因子，形成管腔内血栓，最终导致急性心血管病事件。因此，上述几个环节构成了近年来AS基础和临床研究中干预的靶点。
（四）动脉粥样硬化的危险因素研究进展
虽然AS的病因至今不明，但通过大量的流行病学调查和大规模随机临床试验，已知有多种与AS相关的危险因素，这些因素可分为三类：（1）由遗传决定的危险因素：如家族史、性别、年龄等；（2）由环境决定的危险因素：如吸烟、饮食、体力活动、感染、空气污染等；（3）由遗传和环境共同决定的危险因素：如血脂异常、高血压、肥胖、糖尿病、高半胱氨酸血症、高纤维蛋白原血症、C应蛋白升高等。著名的美国心血管病流行病研究—费明翰研究根据性别、年龄、总胆固醇水平、高密度脂蛋白水平、收缩压水平和吸烟状况等6个危险因素制定的可预测10年内罹患冠心病危险的计分和量表在西方发达国家人群中具有较高的准确性，已在临床广泛应用。临床试验证明，戒烟、积极控制血脂、血压和血糖水平，可显著降低AS的发病率和死亡率。然而，经典的危险因素具有明显的限制性：（1）这些因素只能解释大约50%的冠心病危险的变异；（2）多个危险因素的综合作用显著大于单个因素作用之和，提示表型各异的危险因素可能具有共同的信号激活和放大通路；（3）危险因素具有明显的地域、种族和人群差异性，费明翰计分并不完全适用于亚洲和中国人；（4）现代的调脂和降压治疗只能分别降低30%和20%左右的冠心病事件发生率。因此，国际上近年采用SNP的全基因组扫描技术，从分子水平寻找AS的易感基因，这不仅有助于阐明基因-基因以及基因-环境间的复杂相互作用，而且有助于发现AS早期诊断的分子标记和早期预防的新靶点。
（五）动脉粥样硬化的相关基因研究进展
随着人类基因组计划的完成以及HapMap计划和蛋白质组计划的实施，寻找AS这类复杂疾病相关基因的研究策略不断发展，定位克隆、定位候选克隆、基因表达谱研究、候选基因分析以及目前基于家系和大规模病例对照的全基因组关联研究等研究策略逐步完善，对于发现AS等复杂疾病易感基因研发挥了重要的作用。
近年来，国际上应用基于候选基因的关联分析和基于全基因组的连锁分析和关联分析策略，在冠状动脉粥样硬化及其并发症的相关基因研究方面取得了重要进展。首先，在心肌梗死家系连锁分析方面，2003年Wang 等采用全基因组扫查方法对一个有13个冠心病患者的家系进行了分析，发现MEF2A (肌细胞增强因子2A)基因是导致该家系患病的致病基因。其他冠心病或心肌梗死家系研究证实该基因是冠心病的致病基因。采用相同的家系连锁分析方法，Helgadottir等分离到两个心肌梗死的致病基因，即涉及炎症和免疫通路的ALOX5AP和LTA4H基因，它们在冠心病发生中的作用得到许多研究的证实。目前用家系连锁分析方法目前已经定位了近30个基因位点，为进一步分离冠心病相关基因奠定了基础。分离和鉴定心血管病易感基因的另一个研究策略是候选基因关连分析，即选择参入冠心病发生发展过程中的相关基因，分析基因内多态位点在患者和正常对照群体中的频率差异，从而确定该多态位点在疾病发生中的作用。采用此方法已发现了数十个冠心病相关基因易感等位基因，如ApoE基因的E4，MEHFR基因的C677T，ACE基因的DD，ApoB基因的GG，PAI1基因的4G/5G等。十五期间本课题组利用从北京地区多家医院收集到的冠心病病例对照样本，对引起AS的一些候选基因进行了关联分析，证实了一些候选基因在中国人群AS发生中的作用。然而，以上研究均基于单个基因或少数基因，由于冠心病是一种由遗传-环境因素相互作用所导致的具有高度异质性和复杂性的多基因遗传性疾病，单个基因研究具有很大的限制性。此外，一些研究者进行了多个候选基因的病例对照关联分析，McCarthy等同时分析了111个候选基因210位点,Yamada 等分析了71个候选基因的112个位点，分别发现3个候选基因与冠心病/心肌梗死关联。但是，这些大规模多候选基因研究依然缺乏在整体水平上对疾病的分析，也未能对基因-基因、基因-环境的相互作用进行深入探讨。
新近发展起来的以第三代DNA多态位点——单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphism, SNP）为标记的基于全基因组的关联研究策略是一种不基于假设的、无偏倚的、全面筛选新基因的策略，从而克服了以往方法存在的局限性，所利用的多态位点SNP在基因组中分布广、密度高、易于分型，对于鉴定复杂疾病的易感基因具有巨大的潜力。通过连锁或关联分析定位疾病易感基因后，SNP不仅可以作为遗传标记，而且某些SNP本身即可直接导致疾病，称为功能性SNP。因此，SNP在复杂疾病的早期预测、早期预防、早期诊断和早期治疗方面具有重大应用价值。随着SNPlexTM、多重PCR-INVADER、GenomeLabTM SNPstream等高通量基因型鉴定技术的发展，使得采用数千个甚至更多标记位点在全基因组中扫描疾病相关变异成为可能，为在分子水平上研究AS的发生和发展机制开辟了全新的思路，2002年，Ozaki等应用高通量的多重PCR-INVADER检测方法，采用13738个基因的92788个SNPs标记，对1133例心肌梗死患者和1878例正常对照者进行了关联分析和功能研究，发现淋巴毒素-α的（lymphotoxin-α, LTA）基因变异（252A>G，Thr26Asn）是心肌梗死的易感基因。他们的进一步研究还发现LTA的配体基因LGALS2也是心肌梗死的易感基因，提示了分析基因网络作用的重要性。2005年，美国CELERA研究小组采用分层分析方法从6891个基因的11053个SNPs中筛选出4个心肌梗死易感基因。在国家“十五”863的支持下，本课题组利用已建立的大规模SNP分型技术平台和独创的连锁不平衡计算及单倍型分析方法，从分子水平上对AS的发生和发展机制展开了基于多个生物通路的系统性研究，并取得了初步结果。我们首先对冠状动脉粥样硬化发病机制密切相关的抗氧化通路、炎症通路和凝血－纤溶通路、脂质代谢通路中的近300个重要基因进行了单倍型标签SNP（TagSNP）筛查，确定了这些基因中的约3000个SNP位点，并对其中1500个SNP进行了系统的研究。我们利用目前国际上最先进的高通量基因分型系统（Illumina BeadLab Genotyping System）进行了基因分型工作及与冠心病的关联分析，发现116个SNP和41个单倍型与冠状动脉粥样硬化相关（P<0.05，Pmin=0.00008），初步确定了38个中国人冠心病易感基因。其中炎症通路中的ITGA2、CD36、VCAM1，抗氧化通路中的PON1和凝血－纤溶通路中的F5等与冠状动脉粥样硬化的发生高度相关。此外，通过进行白人和黑人的比较，我们观察到由于群体差异而造成的SNP频率差异，其中部分表现在冠状动脉粥样硬化相关的阳性位点上，提示冠状动脉粥样硬化存在人群遗传异质性，在不同群体中可能存在发病机制上的差异，提示在中国人中开展冠心病易感基因和发病机制的研究有着其他人种同类研究不可替代的意义。
（五）动脉粥样硬化的药物基因组学研究进展
近年来，在利用基因组学知识探讨心血管疾病发生机制的同时，国内外学者也已将基因组技术用于心血管治疗药物的研究，通过这些研究不断发现了药物治疗的新靶点，同时也发现了导致药物治疗个体差异的个体基因变异，包括药物代谢酶基因、药物运转蛋白基因和药物受体基因和药物靶分子基因，这些基因的变异不仅引起药物代谢的差异，而且也影响了药物的疗效。一些学者采用候选基因分析方法研究了药物代谢酶基因多态性对于药代动力学的影响、药物受体基因多态性对于药效动力学的影响以及药物转运蛋白基因多态性对于药物的吸收和清除速率的影响，取得了显著的进展，部分研究结果已开始用于指导临床个体化用药。2004年12月美国FDA批准将“AMPLICHIP细胞色素P450基因分型试验”的个体化治疗基因型诊断芯片用于临床。尽管基因导向型药物治疗已经拉开了序幕，但现有的研究只局限在部分候选基因，存在着明显的限制性。因此，AS药物基因组学的研究大有可为，前景辉煌。
二、课题组主要研究技术国内外专利申请和授权情况
由于 SNP在疾病（尤其是复杂疾病）的基础研究和早期预测、早期诊断、早期预防和早期治疗方面具有重大应用价值，许多国际公司和组织对此进行了大量研发，近年来高通量基因型鉴定技术的迅速发展，如SNPlexTM、GenomeLabTM SNPstream等，使得采用数千个甚至更多SNPs在全基因组中扫描疾病相关变异成为可能。SNPlexTM技术是美国应用生物系统公司（ABI）公司的专利技术。该技术应用3730xl或3730 DNA分析仪的试剂和软件系统，结合通用的OLA/PCR和ZipChute探针杂交技术，可以提供高通量SNP基因型分析。GenomeLabTM SNPstream技术也是一种高通量的基因分型技术，应用微孔反应板，可以同时检测48个SNP位点。与SNPlex技术相比，缺点之一是必须应用专门的硬件设备。
生物芯片是将生命科学与微电子学相交叉结合发展起来的新技术。1992年，美国Affymetrix公司制造的第一张基因芯片诞生。该公司开发了拥有国际专利的寡聚核苷酸原位光刻合成技术。Affymetrix公司的SNP检测基因分型芯片(Genotyping Chip) 应用独具创新的PM-MM（perfect match-mismatch）寡核苷酸探针技术。该公司于2003年制造了10K的SNP芯片(GeneChip)，2004年推出的100K的SNP芯片， 2005年底推出的500K芯片覆盖全基组的500,000 SNPs。500K芯片与10K和100K芯片应用同样的技术，但可得到数倍或数十倍的遗传信息。Affymetrix的500K芯片是目前最先进、容量最大的芯片。
Illumina公司的光纤微珠芯片技术以其完全不同于传统芯片的技术成为芯片界的后起之秀，是新一代的芯片技术平台。微珠芯片具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、制作简单、芯片面积小等特点。这是目前世界上信息量和精确度最高及最具灵活性的基因分型和基因表达研究平台。
从1988年国际上第一个与SNP相关的专利申请至今，SNP研究领域的专利申请大幅度增长，1997年以来增幅尤为明显。目前，世界知识产权组织、澳大利亚和美国在SNP专利排行榜中位居前三名，三者的SNP专利件数占世界总SNP专利件数的一半以上。截至2003年，我国只有6个SNP相关专利，到2006年上半年，我国SNP相关专利件数估计已超过400项。在本课题组以往有关AS的研究中，我们对20多个重要阳性SNP位点进行了专利申请RS3212556，RS2640734，RS17664，RS6433362，RS1800780，RS6954345，RS10036648，RS2297221，RS1054516，RS10010472，RS3176867，RS3211883，RS3212476，RS224759，RS10953143，RS7738，RS26678，RS9640632，RS2282852，RS1445941，RS2297409，RS2690381，RS2056403，RS6743724，RS4571602）。与此同时，我们利用Affy500K芯片在部分中国人冠心病患者中开展了全基因组SNP关联研究，并自行开发了一套基因-基因互作分析方法，分析了各个生物通路内部以及各个生物通路之间的大量SNP位点的联合效应与AS的关联关系，构建了基因互作网络结构，探讨了网络效应对疾病发生的作用。
三、科学问题和研究方向
虽然近年来国内外学者在AS的基础和临床研究领域中取得了一系列突出的成就，但仍存在下列重大问题亟待解决：
1．我国心血管疾病的患病率和死亡率正处于快速上升时期，依靠目前临床实施的主要面向AS中晚期患者的诊治技术，无法遏制心血管疾病的节节攀升。另一方面，基础研究所取得的众多成果一直停留在实验室阶段。认真抓好转化医学，尽快将基础研究成果转化为临床防治技术，已势在必行。
2. 我国至今尚无一个符合国际标准、全国多中心参与、具有地域代表性、研究资源共享的AS标本库和数据库，这对于我国AS基础和临床研究的深入开展是一个严重的瓶颈因素。
3. 目前冠心病的临床预测主要依据美国费明翰计分和量表，但其依据是冠心病危险因素的数量和强度，因而并非早期预测，且明显高估我国人群的冠心病危险。从冠心病的易感基因入手，发现冠心病的特异性遗传标记，有可能使冠心病的防线大大前移。
4. 目前冠心病的临床分型主要依据临床症状、心电图检查和血清学检查，这种分型方法只是针对晚期防御而非早期预警。将患者的分子遗传信息与临床表现相结合，制定冠心病的分子分型标准，将使冠心病的诊断深入到分子水平，有可能达到早期诊断和个体治疗的目的。
4. 目前冠心病的药物治疗主要依据临床试验的结果，全部患者服药只能达到使少数患者避免心血管病事件的目的，但临床上事先无法预测哪些患者服药显效、低效或无效。研究药物敏感性相关基因及其突变规律，有可能达到冠心病患者个体化治疗的目的。
为了解决上述问题，本课题组拟综合利用全基因组基因SNP和重要候选基因SNP关联分析方法，并与功能研究相结合的多阶段多层次的研究设计策略，在我国已经收集的冠状动脉粥样硬化病例对照资料的基础上，建立临床多中心协作网络，收集大样本病例资料和相匹配的对照资料，通过对全基因组基因SNPs进行多层次分析筛选，发现与我国冠状动脉粥样硬化发病危险显著关联的等位基因，并通过分析基因－基因和基因－环境交互作用，发现AS的易感基因和药物敏感基因以及与之相互作用的环境因子，研制出针对高危人群的检测方法和试剂盒，为AS的早期诊断和个体化治疗提供基础。
3.3课题主要研究内容、拟解决的技术难点和可能的创新点，及技术风险分析（包括技术障碍、解决途径及风险因素）
一、主要研究内容
（一）建立国际一流的冠状动脉粥样硬化标本库和数据库
1. 建立一个符合国际标准、全国多中心参与、具有地域代表性、研究资源共享的病例资料收集、保存和利用的中国人冠状动脉粥样硬化标本库和数据库，为我国冠心病的基础和临床研究提供强大的技术平台；
2. 组建多中心临床协作组：组建以山东大学齐鲁医院为牵头单位，包括首都医科大学附属安贞医院、中国协和医科大学阜外心血管病医院、复旦大学附属中山医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、中山大学附属第一医院、四川大学华西医院和西安交通大学医学院附属第一医院等7个医院组成的冠状动脉粥样硬化资源收集及利用全国多中心临床协作组；
3. 按照统一制定的标准（见技术路线部分）收集3500例正常人和3500例冠心病患者，在两组受检者中，按照统一设计的问卷格式，收集病史、家系、查体、实验室检查、治疗、随访等资料，采集静脉血，分离血细胞和血清样本，在部分患者中采集组织标本，建立共享标本库，为开发和验证分子诊断方法以及相关药物临床试验奠定基础。
4. 按照统一制定的标准（见技术路线部分）收集2000例具有冠心病高危因素的患者，进行低密度SNP检测基因芯片的验证和随访研究。
（二）建立基于多个遗传标记（SNPs）的中国人冠状动脉粥样硬化个体化危险性评估和预警模型
AS是由多种基因和多种环境因素以及基因与环境因素相互作用所致的全身性、异质性疾病，因此，一方面需要从众多基因中筛选出易感基因的关联SNP位点，另一方面还要通过分析多个易感基因之间的相互作用以及它们与环境因素的相互作用，在此基础上建立有效的个体化危险性评估和预警模型。
1.采用候选基因与全基因组基因功能SNP分析相结合的策略筛选关联SNP：（1）候选基因分析：我们在前期工作中发现116个SNP和41个单倍型与冠状动脉粥样硬化相关，初步确定了38个中国人冠心病易感基因，本研究将在此基础上对这些SNP位点在下述的1000对冠心病-病例对照人群（关联位点组1和关联位点组2）进行验证，明确这些SNP位点及其组合在冠状动脉粥样硬化中的作用；（2）全基因组基因功能SNP分析：由于候选基因只是目前已知的参与AS发生发展过程的基因，尚有很多与AS相关的基因未被发现。因此，本研究将以三组各500例明确诊断为冠心病的患者及性别、年龄相匹配的正常对照组为研究对象，从全基因组所有基因中选择8－10万个功能SNP，采用分层筛选方法从全基因组筛选关联SNP位点及其组合：首先，在第一组500对病例-对照者分析8－10万个功能SNP，筛选出与疾病关联的SNP位点（关联位点组1，预计为300－500个位点）；其次，将这些新发现的关联SNP位点与我们前期发现的关联SNP位点合并，共同在第二组500对病例-对照者中进行分析，进一步筛选与疾病关联的SNP位点（关联位点组2）；最后，将关联位点组2的结果在第三组500对病例-对照者中进一步验证。在三组病例-对照者中均显示关联的SNP方做为冠心病关联的SNPs。
2. 确认最佳SNP位点：对以上应用候选基因分析法和全基因组分析法从三组冠心病病例-对照筛选得到的关联SNPs进行位点间相互作用的遗传网络以及与表型（临床特征、冠脉病变、炎性因子、血脂水平等）的关联分析，筛选出可用于中国人冠状动脉粥样硬化个体化危险性评估、早期诊断与分子分型的最佳SNP位点约100－200个；
3．针对获得的100－200个最佳SNP位点，开发一种用于位点筛选的高维统计学方法，以此分析并鉴定出一组最佳遗传易感性标记物组合，设计和研制低密度SNP检测基因芯片技术，使其能达到人群个体化危险性评估、早期诊断与分子分型、病程监测与用药指导的要求。
4．对研制的低密度芯片进行临床试验：（1）在剩余2000例冠心病患者和剩余2000例正常人中，对自行研制的SNP芯片诊断冠心病的准确性进行验证，计算诊断的敏感性、特异性和准确性；（2）在此2000例正常人和2000例具有冠心病高危因素的患者中，应用自行研制的SNP芯片预测冠心病的准确性进行验证，对这些人群进行10年的长期临床随访（在本课题年限内可随访1-2年），每年随诊一次，观察冠心病事件（包括猝死、心绞痛和心肌梗死）的发生率，随访结束时与费明翰计分的结果进行比较。同时在两组中各选择500例正常人和500例冠心病高危因素患者，随访开始和结束时各进行一次64排冠状动脉CT检查，观察≥一支冠状动脉狭窄≥50%的发生率以及斑块的形态学变化。
（三）冠状动脉粥样硬化发生和发展过程中的分子表型分析
分子表型（molecular phenotype）包括基因、蛋白、RNA和其它生物分子以及它们之间的相互作用，是决定临床表型(clinical phenotype)和病理生理过程转归的分子基础。在本研究中，我们拟对不同程度冠脉斑块病变的患者进行特异性基因表达谱标签鉴定、相关蛋白组谱鉴定以及代谢组分析等多方面研究，并经生物信息学处理，确定各种分子表型与临床表型及病例生理过程转归的关系，同时确定涉及的易感基因、生化途径和信号通路。为理解冠状动脉粥样硬化发生机制、早期诊断及预后评估提供依据。
1. 应用高频血管内超声（IVUS）技术，可在活体内观察到II－VI型病理学改变的冠状动脉斑块。选择不同类型（II－VI型）病例各30例和正常对照30例做为研究对象；
2、采用表达芯片和蛋白组分析方法，分析不同类型患者血液中单核细胞基因表达和蛋白表达差异，筛选新的分子标记；
3、对比分析不同类型冠状动脉粥样硬化患者血清蛋白及其它分子差异，筛选新的分子标记；
4、根据不同类型患者表型变化，结合基因型分析数据，鉴别特异性分子标志；
4. 对筛选出的新的标记分子在大样本冠心病患者中进行验证；
5. 将经大样本验证研究证实的标记物制成检测试剂盒，并进行临床试验和随访观察。
（四）重要候选基因和强关联功能SNP的功能研究
早期筛选高危病人固然重要，但阐明这些基因位点在冠心病发生和发展中的作用机制及信号通路不仅能发现更多可用于检测的新位点，还可以发现新的药物靶点和内源性保护物质。因此，本研究拟在以上关联分析的基础上，通过文献检索和生物信息分析，选择可能具有重要功能的基因进行功能研究。
1. 选择以上筛选得到的10－15个强关联SNPs位点进行功能分析，分析这些SNP位点的不同等位基因及等位基因组合对基因产物功能的影响；
2. 选择对血管内皮细胞损伤保护系统的基因多态位点，通过定点突变方法研究这些基因变异对血管内皮细胞功能的影响；
3. 分析重要功能基因相关通路基因，探讨多个基因的相互作用;
4. 在以上分析基础上筛选新的药物靶点、标记分子和内源性保护物质。
（五）筛选特定药物敏感或耐受的分子标记，指导个体化治疗
心血管疾病治疗药物存在明显的个体差异，这些个体差异可能是由于药物代谢酶、药物转运蛋白、药物受体和药物靶点分析基因变异所致，本研究拟对AS治疗药物的个体差异的分子基础进行分析，建立可以指导个体化药物治疗的基因型诊断芯片，在此基础上提出中国人冠状动脉粥样硬化个体化治疗方案。具体研究内容包括：
1. 选择明确诊断的冠心病患者1200例，随机分为4组，每组300例，分别给予统一剂量的辛伐他汀、阿司匹林、培哚普利和美托洛尔，分别记录每组患者的实验室疗效判定指标：LDL水平、血小板聚集率、肱动脉内皮舒张功能和心率的变化；
2. 以药物代谢酶、药物转运蛋白和药物靶点基因为候选基因，选择基因内功能SNP进行基因分型；
3. 分析药物代谢酶、药物转运蛋白和药物靶点基因多态药物疗效关联分析;
4. 采用遗传网络分析模型综合分析药物关联SNP、个体易感基因SNP和药物疗效的关系，研制个体化药物治疗基因型诊断芯片；
5. 在另外2000例冠心病患者（分为4组，每组500例）中进行芯片准确性的临床验证，分别应用上述四种药物，测量上述疗效指标的变化，并与芯片预测的结果进行比较；
6. 在以上工作基础上提出中国人群冠状动脉粥样硬化个体化治疗方案。
二、拟解决的技术难点
（一）标准统一及质量控制问题
高质量的病例－对照设计是疾病关联研究成功的核心环节。对于冠状动脉粥样硬化这样的异质性很强的疾病，严格的“疾病”和“对照”定义标准、标准的统一、检测指标的标准化及质量控制等都是至关重要的。本研究在研究设计中充分考虑这些因素，拟通过课题组统一培训和设立中心组抽样检查等手段来做到标准统一和质量监控。
（二）SNP位点筛选的方法
将利用国家人类基因组南方研究中心黄薇教授课题组已建立的各种不同通量标准的基因分型技术平台[包括Illumina BeadLab Genotyping System、ABI 7900HT SDS (Taqman)、ABI 3730xl DNA Analyzer (SNPlex, sequencing)、SNPSTREAM 2006 年863课题,这些都是中标的吗 看看有没有我要的领域的 我好想看看，谢谢啦 [s:60] [s:61] 迫切 [s:47] 强人一个 a look look first, thanks a lot 需要回复后才能看到，多谢分享。 ??????????????????????? 看看是中标的吧，可能有参考价值 一定要学习
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