分子标记 introduction
20世纪80年代以来，以DNA多态性为基础的分子标记技术蓬勃发展起来。DNA分子标记(DNA molecular markers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与形态学、细胞学标记等相比，DNA分子标记具有如下特点：(1)直接以DNA形式表现，因而可以对各发育时期的个体，组织、器官甚至细胞作检测，不受环境影响，也不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍布整个基因组；(3)多态性很高，无须专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状也无必然连锁；(5)多数分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合与杂合基因型，提供完整的遗传信息；(6)操作相对简便。由于以上优点，分子标记已成为遗传图谱构建、QTLs定位、分子标记辅助选择、遗传多样性分析、杂种鉴定等研究的重要手段。目前，常用的分子标记有：（1） RAPD技术
随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是在PCR基础上发展起来的分子标记[57,58]。它以基因组DNA为模板，以一个随机的寡核苷酸序列(一般为9～10 bp)为引物，通过PCR扩增反应，电泳后检测DNA序列的多态性。RAPD多态性来源于与随机引物结合的靶位点的突变，或引物结合位点间DNA碱基序列的缺失和插入。RAPD多态性如是由于引物结合位点的突变引起的，则属显性标记；若引物结合位点不变，而由于引物结合位点间的短的片段缺失、插入而引起的，则属共显性标记。前者无法区分杂合基因型与纯合基因型。
RAPD标记的优点是，商品化的RAPD引物基本能覆盖整个基因组，检测的多态性较高；对DNA需要量极少，对DNA质量要求不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。
RAPD标记的不足之处是：一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合基因型，因而提供的信息量不完整。另外，由于使用了较短的引物，RAPD标记的PCR易受复性温度、变性时间、模板的浓度、Mg2+的浓度、引物的浓度及序列、dNTPs的浓度、聚合酶的浓度、热循环仪等各种实验条件的影响，结果的重复性较差。不过，只要扩增到的RAPD片段不是重复序列，则可将其从凝胶上回收并克隆，转化为SCAR标记，以进一步验证RAPD分析的结果。
RFLP技术
限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）是Grodzicker在1974年提出的。其基本原理是由于酶识别序列内的点突变或部分DNA片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位点的缺失或获得，导致酶切位点的改变，利用限制性内切酶酶切DNA时，就产生了大量的多态性片段。基本操作步骤：DNA的纯化、酶切、凝胶电泳分离DNA片段、转膜、利用放射性同位素标记的DNA探针进行Southern杂交。
RFLP标记具有共显性特点，可以区别纯合基因型与杂合基因型，能够提供单个位点上较完整的资料，结果稳定可靠，重复性好。但由于小麦是严格自花授粉作物，基因组较大，多态性较低，且RFLP技术对DNA需要量较大(5-10 g)，所需仪器设备较多，检测步骤多，技术较复杂，周期长，成本高，有时还需要同位素标记，所以其应用受到了一定程度的限制。
AFLP技术
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)技术是Zebeau和Vos[发明的一项专利技术，其原理是：植物品种基因组DNA经酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性DNA片段，用特定的同功酶切点互补的接头连接在酶切片段的两端，然后用特异同结头互补的引物进行PCR扩增、电泳、放射性或非放射性显示DNA指纹。
AFLP技术结合了RFLP和RAPD的优点，稳定可靠，重复性好，方便快速，只需极少量的DNA样品，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的序列信息，而且绝大部分为显性标记，显示的多态性信息量也很高。因而，非常适合于品种指纹图谱的绘制、遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。
AFLP技术在实际操作中，存在以下问题：受专利保护，试剂盒价格昂贵，检测费用高；有时需同位素测定，操作过程较为复杂，对操作人员技术要求较高；对DNA的提取纯度和内切酶质量要求严格。
SSR技术
简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)又称微卫星(Microsatellite)，是由一组1-6个核昔酸串联在一起的序列重复。它们普遍存在于高等生物中，并分布于整个基因组的编码区和非编码区。
每个SSR座位的两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因而可以根据SSR的侧翼序列设计特异性引物来扩增微卫星位点，通过电泳来检测等位基因的变异，这种技术称之为SSR标记或序列标记微卫星位点（Sequence tagged microsatellite sites，STMS）。
SSR作为遗传标记的优点是[86]：SSR位点在整个基因组中分布广泛、均匀且数量充足，多态性极其丰富；SSR标记呈孟德尔共显性遗传，可以区分纯合与杂合基因型；仅需要少量DNA，且质量要求不高。因而此标记已广泛应用于目标基因标记、绘制连锁图及种质资源鉴定等方面，是比较理想的分子标记。
限制SSR标记技术应用的瓶颈是：SSR引物的开发难度大、费用高，现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因；具有种属特异性，仅少数引物可以在亲缘关系较近的物种中应用。但随着分子生物技术的发展，出现了许多新方法，如SAM、STMP、数据库检索法等，加快了引物开发的进程。随着小麦SSR连锁图谱饱和度日益增高，SSR标记技术应用范围会不断扩大
ISSR技术
ISSR(Inter-simple sequence repeat，简单重复间序列)是由Zietkiewicz[等于1994年创建的一种简单序列重复间扩增多态性分子标记。ISSR的基本原理就是在SSR的3’或5’端连接1～4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ISSR标记的多态性。ISSR技术的原理和操作与SSR、RAPD非常相似，只是引物设计要求不同，但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富，可以提供更多的关干基因组的信息，而且比RAPD技术更加稳定可靠实验重复性更好[88]。
ISSR根据植物广泛存在简单重复序列的特点，利用在植物基因组中常出现的简单重复序列本身没计引物，无需预先克隆和测序。通常为显性标记，呈孟德式遗传，具有很好的稳定性和多态性，DNA用量少、技术要求低、成本低廉、且PCR扩增时退火温度在52℃左右，保证了PCR扩增的可重复性，因而利用ISSR标记建立品种的指纹图谱，用于品种纯度和真实性鉴定是很有潜力的方法。然而，ISSR标记技术也有不足，其不足之处在于：扩增反应的最适条件需要一定时间的摸索；大多为显性标记，无法区分杂合和纯合基因型。
SNP技术
SNP(single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态)是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式[92]。单核苷酸多态性是许多物种基因组中最常见的变异形式，在基因组中的分布频率很高。SNP标记通常具有双等位基因多态性，其突变率相当低，是一种稳定的突变。而且SNP标记密度高，富有代表性且易实现分析自动化。检测SNP的方法有DNA芯片技术、阵列杂交分析、同源杂交法及直接测序法等。其中以DNA芯片技术方法最佳，已得到大规模的发展与应用。
SNP具有在基因组中数量多、分布密度高等特点，而且在基因分型过程中不需要根据片段大小将DNA分带，可以大规模地高度自动化地完成，比以SSR标记为代表的第二代分子标记工作效率更高，更适于大样本量检测分析，因此SNP标记被认为是很有应用前景的分子标记技术。
兄弟你也做分子标记不？
呵呵
同行啊 [s:90] [s:90]
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