【资料】自体干细胞移植治疗下肢缺血性疾病
自体干细胞移植治疗下肢缺血性疾病第一部分 干细胞基础知识
一、干细胞的基本概念
干细胞指具有无限或较长期的自我更新能力，并能分化出至少一种高度分化子代细胞的细胞。在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞，但随着年龄增长，干细胞的数量逐渐减少，其分化潜能也逐渐变窄。在干细胞发育过程中，还有一种中间类型的细胞称为祖细胞，祖细胞具有有限的增殖和分化能力。与干细胞不同的是，祖细胞没有自我更新能力，它在经过几轮细胞分裂周期后产生的两个子代细胞均为终末分化细胞。
二、干细胞分类
（一）根据其分化潜能的宽窄
1.全能干细胞
2.三胚层多能干细胞
3.单胚层多能干细胞
4.单能干细胞
哺乳动物的生命周期始于受精卵，受精卵具有分化成体内200多种不同细胞类型的潜能，并能发育成一个完整个体，细胞的这种潜能称全能性，具有这种潜能的细胞则称为全能干细胞。受精卵在从输卵管向子宫运行的过程中不断地进行卵裂，当分裂到8-16个细胞时为一实心球体，称为桑椹胚。此时每个卵裂球仍保持这种全能性，都可发育成一个完整个体。桑椹胚进入子宫后不久，分裂成为由32-64个细胞组成的早期囊胚或称胚泡，开始出现腔隙，称为囊胚腔。囊胚腔由一层细胞围成，这层细胞称为滋养外胚层，一端为内细胞团，这是在整个胚胎发育过程中最早发生的细胞分化。内细胞团细胞虽失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括生殖细胞在内的各种细胞的潜能，具有此潜能的细胞称为多胚层多能干细胞。单胚层多能干细胞的分化潜能较前两者要窄许多，它只能分化成几种特定类型的细胞，如间充质干细胞通常只能分化形成骨、肌肉、软骨、脂肪及其他结缔组织，不能分化为除此以外的其他组织。有的干细胞如神经元干细胞只能分化成神经元，不能分化为显形胶质或少突胶质细胞，这种细胞称为单能干细胞。
（二）根据细胞来源
1.胚胎性干细胞 通常指源自囊胚内细胞团的ES细胞，但通常人们将从畸胎瘤中分离出来的内皮细胞和从早期胎儿原始生殖细胞中分离、筛选到的内皮细胞也归为胚胎干细胞。
2.成体干细胞 指那些组织或器官特异性干细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳态。早先人们认为在一些经常更新的组织如血液、小肠黏膜、表皮等中才存在着干细胞，这些干细胞负责机体的更新与创伤的愈合。近年来的研究结果表明一些曾认为成熟后不再进行分裂的组织，如脑、肝中也存在着干细胞。随着研究的逐步深入，有关成体干细胞的研究报道越来越多，发现有干细胞存在的组织类型也越来越广泛，这些组织包括：骨髓、外周血、脑、血管、骨骼肌、肝、胰、皮肤和胃肠道的上皮及脂肪等。
成体干细胞究竟源于何处尚未有定论。目前较流行的说法有两种：一种说法是成体干细胞是在个体发育过程中残留下来的胚胎干细胞，另一种说法是成体干细胞是成体细胞在某些情况下(如外伤等)经过重新编程后形成的，甚至是细胞间自发融合的结果。究竟哪种说法正确，有待进一步研究证明。
三、干细胞的共同属性
1.干细胞是能自我维持的细胞群体，它的数目是维持恒定的。
2.在总的细胞构成上干细胞只占很小一部分。
3.干细胞是相对未分化的细胞。
目前用于科学研究和临床应用的干细胞主要是成体干细胞，主要包括骨髓干细胞、外周血干细胞和脐血干细胞3种。本文也主要以这3种干细胞移植技术在下肢缺血中的应用介绍为主。
第二部分 自体骨髓血的抽取技术
一、需要的设备和试剂
骨髓活检穿刺针；普通肝素；生理盐水；无菌瓶（储存骨髓血）；载玻片；10ml注射器；利多卡因；床旁心电血压监护设备。
二、操作步骤
病人取俯卧位，接好床旁心电血压监护设备。常规碘酒、酒精消毒术野，铺无菌巾单。
用1%的利多卡因分别在双侧的髂后上棘部位作局部麻醉。注意：必须将麻醉药注射到髂骨的骨膜层，否则穿刺及抽取骨髓时，患者会有明显的酸痛。
然后用骨穿针进行多点穿刺。
穿刺的深度因患者的胖瘦而异，但总的来说，合适深度应为骨穿针被髂骨所固定，针尾无法水平推动。
抽取骨髓时，先抽取1ml做骨髓涂片以排除血液病（最好在术前完成这一检测），然后用已抽取1ml肝素盐水的10ml注射器，抽取9ml的骨髓血。
抽取时要有一定的负压，以使处在蜂窝状骨间隙中的骨髓细胞更多地被抽取出来。
但速度也不要太快，可以每抽取50ml左右就停一会儿。
同时加快输液速度，必要时给予血浆代用品或输血。
我们推荐使用多侧孔骨髓穿刺针，多点多方向抽取，这样可以抽取更多的骨髓细胞。
将抽出的骨髓血缓慢贴壁注入无菌瓶中，使之不产生泡沫。
同时不断晃动以使肝素混匀避免凝血。
抽取300-400ml左右的骨髓后，拔出骨髓穿刺针，压迫3-5min。
包扎穿刺点，将病人送回病房等待下一步的操作。
将盛有骨髓血的无菌瓶封好，由专人送到干细胞分离室进行下一步的操作。
第三部分 骨髓干细胞的实验室分离和提取
1. 骨髓血的收取、转送应由专人负责。
2. 骨髓干细胞的制取必须严格无菌操作。
（1）在无菌操作间及洁净工作台中进行骨髓干细胞的制取。洁净工作台的洁净度一般要求达到百级。
（2）制取前无菌操作间及洁净工作台要经紫外线消毒1h后方可使用。
（3）进入无菌操作间前，要在缓冲间内戴好口罩、帽子、手套，穿好隔离衣，换上专用拖鞋，再经风淋室进行风淋。
骨髓干细胞的实验室制取过程
根据Stokes 公式：沉降系数S =2γ玻é裵-ρm）/9η
按照骨髓干细胞自身的细胞密度与分离介质密度之差，选择合适的密度的细胞分离液，以密度梯度离心法进行分离提取。
步骤：
1. 差速离心法沉淀红细胞
（1）骨髓血中加入含有羟乙基淀粉的骨髓干细胞分离液，混匀后，室温静置，进行重力沉降。
（2）吸取上层液体加入离心管中。
（3）以600-800g离心5min。
2. 制备细胞悬液
（1）弃去上清液。
（2）沉淀细胞以PBS或生理盐水制备细胞悬液。
3. 密度梯度离心法分离单个核细胞
（1）另取一支离心管，加入骨髓干细胞分离液。
（2）将细胞悬液沿管壁缓缓加于细胞分离液的顶部（表面）。
（3）以400-500g离心15min。
根据Stokes 公式：当细胞颗粒密度（ρp）等于分离介质密度（ρm），即：ρp =ρm ，离心时的细胞颗粒悬浮于分离介质中不移动。
骨髓干细胞分离Ⅲ液为密度范围在1.075-1.079之间的一种梯度介质。
骨髓干细胞密度范围在1.062-1.080之间。
离心后在上层含有细胞碎片的细胞分离液与下层红细胞之间，可见一明显细胞区带。
吸取此细胞区带层，加入离心管中。
以PBS或生理盐水600-800g离心5min，洗涤3次。
4. 计数细胞数
5. 流式细胞仪鉴定或纯化骨髓干细胞
6. 以生理盐水悬浮洗涤后的细胞至所需容量
输入容量参考值：
肌肉注入容量：40ml左右
导管输入容量：10ml左右
制取完毕后的骨髓干细胞由专人转送手术室或导管室
骨髓干细胞的治疗是以人体自身细胞或正常人体细胞直接输入或移植入人体内以替换和替代受损和坏死细胞，从而达到治疗治愈之目的；因此，尽可能地缩短骨髓干细胞的制取时间
减少不必要的步骤，以减少细胞的损伤和丢失，保持细胞完整的结构与功能以及足够的细胞数是非常重要的。
第四部分 自体外周血干细胞的分离和提取
生理情况下外周血中存在着极少量的造血干细胞，但通过应用粒细胞集落刺激因子动员后外周血中造血干细胞数量就会增加，而造血干细胞的细胞形态和比重都类似于淋巴细胞，因此应用细胞分离机的淋巴细胞采集程序就能从外周血中分离出相对较高浓度的造血干细胞。
以下介绍具体操作方法。
首先准备好细胞分离机，设定为淋巴细胞分离程序。
然后给细胞供者进行静脉穿刺，建立静脉通道，需要建立两条静脉通路，一条用于采血进入分离机分离，
另一条用于回输分离后的剩余的血液成份。建立好静脉通路后设定细胞分离机需处理的血容量值。需要说明的是在血液科进行造血干细胞移植治疗恶性血液病时，通常设定此值为细胞供者自身全血容量的2-3倍，大约为8000-10000ml，这是由于移植所需要的造血干细胞数量大所决定的。而治疗局部血管闭塞症所需的造血干细胞数量相对较少，所以此值可相对减低，
我们的建议是设定在6000ml。启动细胞分离机，根据运转时静脉通路的条件设定全血流速，通常为30-50ml/min。细胞供者的静脉血被采集入细胞分离机，通过离心，分离出淋巴细胞样细胞，剩余的细胞成份被回输给细胞供者。采集过程中由于使用了枸橼酸钾抗凝，可能会引起低血钙，导致细胞供者出现手足或口周麻木感，因此在采集过程中需要适量缓慢静脉注射葡萄糖酸钙进行治疗。采集时间一般需要持续2-3h，其间医护人员需要密切注意细胞供者的心律、血压及是否出现过敏性皮疹，询问患者是否有胸闷、气短及麻木感。
采集结束后取出产品袋，我们可以看到尽管处理了数千毫升的血容量，但仅采集到50ml的产品，其他绝大部分的血液成份都回输给细胞供者。在这50ml产品中含有大量的淋巴样细胞，其中含有很高浓度的造血干细胞。
第五部分 干细胞的移植方法
目前我们采用了2种方法进行干细胞移植：缺血肌肉局部注射移植和介入下缺血下肢动脉腔
内移植。术者可根据患者的实际情况选用不同的移植方法。
一、下肢缺血肌肉局部注射移植法
患者一般采用腰麻或硬膜外麻醉。
麻醉成功后，患者仰卧，常规消毒、铺巾后。
在患肢的局部缺血部位进行多点注射。一般相邻两点间的距离为2-3cm，从上向下顺序注射，每个点注射约0.8-1ml，注射深度在1.5-2cm之间。由于患肢多有严重缺血，需要严格无菌操作，以免感染导致肢体坏死。
故注射完毕后，用乙醇消毒注射部位，用无菌敷料包扎。送患者回病房，整个手术完成。
二、介入法下肢动脉腔内移植法
患者一般采用局部麻醉，仰卧位，常规消毒、铺巾后。
用1%的利多卡因在腹股沟区股动脉穿刺部位作局部麻醉，成功后穿刺股动脉。此时又有2种方法都可以进行动脉腔内干细胞移植。
方法一：顺行股动脉穿刺法。在患侧操作，是指穿刺进针的方向同股动脉血流的方向一致。穿刺并置入5F动脉鞘后，注入3000U的普通肝素。从鞘管放入一导丝和球囊扩张导管到股浅动脉的远端或腘动脉的远端，然后退出导丝，球囊扩张导管的尾部用三通封闭。这种方法主要用于下肢动脉闭塞在股浅动脉以远的动脉腔内干细胞移植。操作方法简单，使用的材料较少，费用也相应较低。
方法二：逆行股动脉穿刺法。主要指在对侧股动脉穿刺，穿刺进针的方向同股动脉血流的方向相反。这种方法主要用于患侧动脉闭塞在股浅动脉起始部以上的动脉腔内干细胞移植；
当然，也可用于下肢动脉闭塞在股浅动脉以远的动脉腔内干细胞移植。操作方法较顺行穿刺复杂一些。
穿刺并置入5F动脉鞘后，注入3000U的普通肝素。
从鞘管放入一导丝，用Cobra导管选择到对侧病变动脉的近段，再在交换导丝的导引下退出Cobra导管，送入球囊扩张导管到达预定部位，然后退出导丝，球囊扩张导管的尾部用三通封闭。
在介入中心，将分离、提取后的干细胞悬浊液倒入无菌容器中，用生理盐水5ml冲洗盛干细胞悬浊液的离心管，冲洗液也倒入无菌容器中。用20ml的注射器抽取干细胞悬浊液，通过上述的球囊扩张导管的尾部用三通缓慢向动脉内注射，注射前先要用造影剂充盈球囊，阻断动脉血流大约在3-5min。阻断动脉血流的目的是希望干细胞能够在动脉腔内和侧支内有一个较长停留的时间，有利于定植到缺血部位。注射完毕后，抽出充盈球囊的造影剂，恢复动脉血流。退出球囊扩张导管并拔除动脉鞘管后，压迫穿刺点20-30min，加压包扎。整个手术完成。将患者送回病房。
第六部分 自体干细胞移植的适应证与禁忌症
一、适应证
慢性下肢缺血患者，包括：
1. 有间歇跛行且静息状态下踝肱指数（ABI）<0.6-0.8；或已有静息痛、溃疡、坏疽。
2. 保守治疗无好转且不适合外科搭桥手术的患者。
二、禁忌证
1. 控制不好的糖尿病患者（HBA1c>6.5%和增生性视网膜病变）。
2. 过去5年内明确有恶性疾病的患者及血中肿瘤标记物水平明显升高者（严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干细胞移植手术）。
第七部分 干细胞移植的术前准备和注意事项
一、术前准备
1.写自体干细胞移植申请单；知情同意书；手术签字；提前安排干细胞提取及分离设备和人员。
2.手术前一天备皮（双侧腹股沟和双小腿操作区）并涂擦安尔碘，用无菌巾包裹，溃疡及坏疽区域勿弄湿。
3.采髓前一天根据患者Hb情况酌情备异体血（压积红细胞）200ml备用。
4.有坏疽感染者做抗生素皮试。
5.术前骨髓穿刺做细胞学检查除外血液病
二、手术注意事项
1.自体骨髓干细胞肌注法/介入法移植术
手术要点：1）抽取的骨髓血必须用肝素体外充分抗凝。2）抽血同时注意输血及补液。3）术中监测血压、心率及氧饱和度。4）体外提取干细胞需严格无菌操作。5）肌注法移植时需要对照术前造影片多点均匀注射到缺血肌肉内。6）介入法动脉腔内移植需要用球囊导管阻断近端血流时注入干细胞，同时给予少量肝素盐水抗凝。
2.自体外周血干细胞移植术
手术要点：1）对入选患者先进行骨髓动员5-7d（用药见附录），使骨髓干细胞充分动员到外周血中，然后采集自体外周血干细胞。2）骨髓动员期间需要每日监测WBC不超过5万/μl，CD34+细胞数在20/μl左右。3）干细胞移植方法同上。
三、术后处理
鼓励患者术后早期下地或床上活动。观察患者治疗前后的下肢缺血的改善情况。
附录：粒细胞集落刺激因子进行骨髓动员时的用法。
洁 欣：150-300μg, ih, Qd, 5-7d
特尔金：150-300μg, ih, Qd, 5-7d
第八部分 干细胞移植手术前后指标观察及检测
1. 患肢紫绀及溃疡面积及深度（mm），坏疽范围测量并标记。
2. 静息痛评分。
3. 皮肤温度测定和肢体冷感评分。
4. 测定静息状态下踝肱指数（ABI）。
5. 经皮氧分压测定TcPO2（mmHg） 。
6. 动脉造影（DSA），观察侧支血管形成情况并评分。
7. 间歇跛行者测定无痛步行时间（分）或跛行距离（米）。
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