新型报告载体pRSET-EGFP的构建及鉴定
实验题目：新型报告载体pRSET-EGFP的构建及鉴定内 容：
一、实验目的
1.构建带有绿色荧光蛋白突变体基因(GFP-S65T)的新型瞬时表达载体pRSET-EGFP。
2.综合运用以前所学的生物化学和分子生物学基本实验技术、方法。
二、实验原理
利用分子生物学技术和方法将pRSET-B质粒改建为带有绿色荧光蛋白突变体基因(GFP-S65T)的新型瞬时表达载体pRSET-EGFP，并在大肠杆菌BL21中得到GFP基因的高效表达。
以原核生物E.coli为表达菌株,构建了一个利于检测提纯的质粒作为载体，它不仅具有一般载体的优点，由于在其基因序列中插入了绿色荧光蛋白的基因，可以瞬时表达，利于检测；并且，在该基因的上游含有一段6个组氨酸（His）的序列，可以利用这段序列与镍离子（Ni2+）进行提纯处理，得到纯化的蛋白。
三、试剂与器材
1、试剂 pEGFP-C1 ，pRSET -B及 BL21，JM109，低分子量标准蛋白，Ni2+柱
引物 P1 5’>GAA TTC ACT GCA GAA GC<3’，
P2 5’>GAA TTC GGT ACC ATG GTG AGC AAGGGC<3’，
2、器材 PCR仪，水平电泳仪，垂直电泳仪，超净工作台，酶标仪，紫外检测仪，
四、操作方法
1.PCR法扩增目的基因GFP，回收扩增产物。
2.双酶切PCR产物和pRSET-B载体。凝胶回收酶切产物。
3.GFP基因与质粒载体pRSET－B连接，构建重组质粒。
4.将重组质粒转化到宿主DE3细胞中。
5.碱裂解法提取重组质粒，酶切电泳鉴定。
6. 重组质粒在SOB培养基中扩大培养，IPTG诱导GFP基因表达，得到表达的绿色荧光蛋白。
7.SDS－PAGE电泳检测绿色荧光蛋白的分子量。
8.Ni2＋亲和柱分离纯化表达的绿色荧光蛋白。
五、关键步骤与注意事项
1．优化PCR反应条件，使GFP基因得到特异性扩增。
2．连接反应时GFP基因与pRST－B载体的比例为4：1，最大比例的重组。
3．感受态细胞制备时CaCl2处理时间、温度严格掌握，转化率要高。
4．PCR扩增及蓝白筛选要设立阴性、阳性对照。
5．IPTG的浓度要适量。
六、思考题
1．为了减少非特异性扩增的出现，PCR扩增时我们应该优化那些条件？
2．如果没有检测到绿色荧光蛋白的表达，可能的原因是什么？
3．如何防止载体质粒的自身环化，得到最大程度的重组？
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