急性毒性试验－LD50测定
急性毒性试验－LD50测定[实验目的] 了解LD50正式实验剂量确定方法和计算，LD50测定的分组法和序贯法的实验步
骤，掌握LD50测定方法。
[实验动物] 小白鼠18-22g。
[材料和药品] 注射器(1ml)，小烧杯（50ml），量筒（10ml），试管，吸管，大镊子，盐酸
普鲁卡因，戊四氮，苦味酸。
[实验方法]
一、 分组法计算LD50
1. 预试实验 取小鼠16只，随机分成4组，组间剂量之比为2:1。记录各组动物死亡率，
粗略获得最大的不致死量（LD0）和最大的致死量（LD100）。
2. 正式实验
2.1剂量确定：在LD0与LD100之间按等比级数插入几个中间剂量组。相邻剂量公比，按
下式计算：
r= （1）
n为欲分组数；b为预试验LD100的剂量；a为预试验LD0的剂量。则各组剂量分另为
a、a r、a r 2、a r3........。
设通过预试验，求得普鲁卡因的LD0为164mg/kg, LD100为250mg/kg，准备分成5组进行实验，各组剂量为多少？
将以上数据代入公式（1）:
r=
logr=log
r=log-10.0458=1.11
故各组剂量分别为a=164; a r=182; a r2 203 ;a r3 =225; a r4 = 250
2.2 给药及观察 取体重18～22g小鼠100只，随机分为5组，每组20只，按表1剂量分组给药，腹腔注入盐酸普鲁卡因，观察并记录死亡百分率。小鼠注射盐酸普鲁卡因后约1～2分钟出现不安症状，继而惊厥，然后转入抑制，陆续有小鼠死亡；不死者一般都在15～20分钟内恢复常态。故观察30分钟内的死亡率。
2.3 结果记录 将结果记录在表1中。
2.4 分组法LD50计算公式(改进寇氏法)
LD50=log-1[Xm-I(Σp-0.5)] (2)
式中Xm为最大剂量的对数（log250=2.3979）；p 为各组动物的死亡率，以小数表示(如80%写作0.8) ；Σp为各组动物死亡率的总和(p1+p2+p3+p4+p5)；I为相邻两组剂量(D)对数值之差即log250-log225=0.0457。
2.5 举例（见表1）
表1 小鼠腹腔注射盐酸普鲁卡因的实验结果
组 别 小白鼠
(只) 剂 量D(mg/kg) LogD=X 死亡数(只) 死亡率
(%) p
1 16 250 2.3979 15 94.0 0.94
2 16 225 2.3522 13 81.3 0.813
3 16 203 2.3075 8 50.0 0.50
4 16 182 2.2601 5 31.3 0.313
5 16 164 2.2148 1 6.3 0.063
Σp=2.626
将各数值代入式（2）进行计算：
LD50=log-1[2.3979-0.0457(2.626-0.5)] =200(mg/kg)
二、序贯法（上下法）计算LD50
1原理 序贯法在计算LD50时并不计算各组死亡率，而是从逻辑学判断，在序贯实验时动物分布应以LD50为中心的常态分布。
2方法 通过预试确定剂量分组，按等比数列安排剂量。预试实验及剂量确定方法同分组法。如表2所示，实验先从大剂量开始，第一只动物用药后，如果发生死亡，在表中以“+”记录，下一只动物就降低一级剂量给药；相反，如果动物存活，在表中以“-”记录，下一只动物就用高一级的剂量。依此类推。最后一只动物虽未进行实验，但在表格内仍占位置，以× 符号表示。本法所用动物数n也应事先定好，一般n=10即可获得满意的结果。
3 计算公式
LD50=log-1（C/Σn） (3)
4 注意事项
4.1本法优点是比较节省动物。缺点是必须一只动物一只动物地进行实验；下一只动物用药剂量又决定于上一只动物的反应情况；实验时间较长。因此本法不适用于药效慢或判断反应需要时间较久的药物。
4.2 计算LD50时动物数并非是所有参与实验的动物，而指有分布意义的动物。因此以第一次变号（由+变-，或由-变+）的前一组开始计算分布数，再前面的动物作为探索剂量不参与计算；而最后一只推算的动物作为有意义的分布，可记入计算。
5举例（见表2）
表2 小鼠腹腔注射戊四氮测定LD50的实验结果
剂量D(mg/kg)
LogD=X 实验结果 S F n n•X
125 2.097 (+) 0 1 0 0
87.5 1.942 + + + + 0 4 4 7.768
61.3 1.787 - + - - × 3 1 5 8.936
42.9 1.632 - 1 0 1 1.632
Σn=10；Σ(nX）=18.336
S（Safe）为存活数； F（Fatal）为死亡数
n (number)为剂量组的动物数； X为logD，即剂量的对数
Σn为动物总数； C=Σ（nX）
将表2中的实验数据代入式（3）计算LD50
LD50=log-1(18.336/10)= log-11.8336= 68.17mg/kg
6 实验步骤
（1）每组各取体重相近的小鼠10只，称重，用苦味酸标记。
（2）取小鼠一只，按体重0.2ml/10g腹腔注射戊四氮。观察10分钟的小鼠死亡情况。根据动物死亡情况确定下一只小鼠的用药剂量：上只动物死亡则降一个剂量组；若未死则增一个剂量组, 依次逐只用药，将实验结果记入表3：死亡用 + 表示，未死用 - 表示。
（3）根据第10只动物死亡情况推断第11只动物应分布在何剂量组，并用×表示。
(4) 并把实验数据代入式（3）计算LD50。
表3 小鼠腹腔注射戊四氮测定LD50的实验结果
剂量D（mg/kg）
LogD=X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 S F n X•n
160.0 2.204
128.0 2.107
102.4 2.010
82.0 1.914
65.6 1.817
Σn= Σ(n X)=
[注意事项]
1. 小鼠体重应相近，以减少小鼠的个体误差。
2. 腹腔注射时应保证药物准确进入腹腔，注意避免注入膀胱或损伤脏器，防止药液外漏。
3. 观察期间应减少对小鼠的刺激，以免引起惊厥，加速死亡。
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