几个与基因工程分子克隆相关的概念
DNA聚合酶1(DNA polymerase I)大肠杆菌DNA聚合酶I (DNA polymerase I)是基因工程中常用的工具酶，主要用于合成DNA。这个酶除有5'→3'聚合酶活性外,尚有3'-5'及5'-3'核酸外切酶活性。由于它具有5'→3'核酸外切酶活性,当用缺口平移法(nick translation)进行DNA探针标记时,常用DNA聚合酶I。
Klenow片段(Klenow fragment)
DNA聚合酶I大片段(large fragmen1 DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶( subtilisin)裂解后产生的大片段,也称为Klenow片段(Klenow fragment)。它保留了5'-3'聚合酶活性及3'-5'外切酶活 失去了5'-3'外切酶活性。它具有的3'→5'外切酶活性能保证DNA复制的准确性,把DNA 成过程中错误配对的核苷酸去除,再把正确的核苷酸接上去。Klenow片段的主要用途有: ①补齐双链DNA的3'末端;②通过补齐3'端,使3'末端标记;③在cDNA克隆中,用于第二股链的合成;④DNA序列分析。
逆转录酶(reverse transcriptase)
逆转录酶(reverse transcriptase)以RNA为模板合成cDNA，常用的逆转录酶有两种, 禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。 酶是以RNA为模板合成DNA,合成方向为5'→3'延伸,无3'-5'外切酶活性。逆转录酶用与以mRNA为模板合成cDNA,是构建cDNA文库和RT-PCR等技术中的关键工具酶。
磷酸碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)
碱性磷酸酶能去除DNA或RNA5'端的磷酸根。制备载体时,用碱性磷酸酶处理后,可防止载体自身环化,提高重组效率，碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase, BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(calf testinal alkaline phosphatase, ClP)。ClP能在1% SDS溶液中68°C加热15分钟而失活,故较为常用。
质粒(plasmid)
质粒是常用的克隆载体，广泛存在于包括细菌、酵母在内的多种微生物中,在宿主细胞的染色体外以稳定的方式遗传。结构上,它是一种双链环状的DNA分子。质粒含有复制起始点,能利用细菌 染色体DNA复制和转录的同一套酶系统,在细菌体内独立地进行自我复制及转录。有的质粒的复制与细菌染色体的复制同步,处于严密控制之下,这类质粒的拷贝数较低。有的质粒的复制比细菌染色体的复制速度快,其拷贝数很高,可达数百甚至上千拷贝。不同的质粒含有不同的抗药性基因和其他遗传标志。
作为克隆载体的质粒应具备以下特点:①分子量小,稳定存在,较高拷贝数;②遗传标志;③内切酶点。 目前,已有一系列符合上述要求的人工质粒作为商品供应。如pBR322是一种使用广泛的质粒,长度为4.3kb,含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。在氨节青霉素和四环 素的抗性基因中间有限制性内切酶位点,便于外源基因的插入和筛选(图13-1 )。另一类使用十 分广泛的质粒是pue系列质粒,全长2. 6kb,由pBR322的氨苄青霉素抗性基因、复制起始位点以及大肠杆菌lac Z基因片段构成。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段,主要用做亚克隆载体。一般说来,外源 DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。
基因组文库(genomic library)
是指含有一个机体基因组DNA的全套重组DNA分子。要获得基因组DNA片段,经典的方法是构建基因组文库,然后从中筛选得到特定的DNA片段。 基因组文库的构建过程也是DNA重组过程,首先从真核细胞中分离高分子量的DNA,其 分子量应大于lOOkD;然后通过一定手段(如限制性内切酶Sau3Al或Mbo I)将基因组DNA切成片段,一般是进行部分消化(控制消化的时间和酶量以达到部分消化的目的) ;用密度梯度离心或琼脂糖凝胶电泳回收15~25kb的DNA片段;回收的DNA片段与适当的载体进行连接,每一DNA片段都与载体拼接成一重组DNA分子,将所有的重组DNA分子都引人宿主细胞并进行扩增,从而获得基因组文库。
理想的基因组文库应含有整个基因组的DNA序列,克隆与克隆之间应有重叠序列,克隆的片段应大到足以包含整个基因及其旁侧序列。最重要的是,文库应当易于用少量的材料构建、目的基因易于筛选。只有入噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库。
cDNA
即互补DNA，由双链和单链形式。以RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。cDNA与原来基因的DNA不同而无内含子。
cDNA文库 (cDNA library)
cDNA是以mRNA为模板合成的互补DNA。要获得全长cDNA片段,构建cDNA文库 (cDNA library)并从cDNA文库中筛选出目的基因,仍然是一个十分有效的方法。虽然一个个体 的所有细胞均具有相同的基因组结构,但在同一机体不同类型的细胞或同一细胞在生长发育的不 同阶段,以及受到不同因素(物理、化学或生物)的刺激,基因表达的种类与数量是不同的。 cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆, cDNA序列与成熟的mRNA相当,不含内含子。只有在细胞内存在mRNA,才能建成相应的cDNA文库,所以不同种类及不 同状态的细胞均有不同的cDNA文库。
构建cDNA基因文库前,必须先从细胞中提取高质量的mRNA。因mRNA有poly(A)尾, 可用寡核昔酸oligo(dT)作为引物,加入四种dNTP和逆转录酶催化第一股链的合成。然后,用 RNase H去掉mRNA,由DNA聚合酶I催化第二股链的合成。修齐两端,加入人工接头（linker） ,再与有关载体连接(图13-8)。构建cDNA文库常用的载体主要有λgt10、Agt11、Aziplox以及某些质粒。由于cDNA是以mRNA为模板合成的，因而cDNA文库比基因组文库要小的多，目的基因的筛选也比较容易。
大概步骤表达如下：cDNA文库的构建
分为六个阶段：
阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链
阶段2：cDNA第二链的合成
阶段3：cDNA的甲基化
阶段4：接头或衔接子的连接
阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
可能大家会感觉这些个东西都比较老了，到处都是
我并不是从网上随意黏贴复制过来的
而是翻阅了几个教科书后扫描或手写打字出来的相对完整和完全的概念
虽然不能给您最前沿的资讯，但是保证给您最经典的概念。 [s:80] [s:80] [s:80] [s:80]
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