重组DNA有哪几种联接方式？
不同来源的DNA片段通过限制性内切酶切断或机械力剪切后,可以在体外重新连接起来, 形成人工重组体。体外连接的方法主要有以下四种。
(一)粘性末端最适合DNA片段连接
大多数限制性内切酶错位切断DNA分子,产生s'或3'粘性末端,如果用同一种酶消化载体 和目的DNA分子,或者载体DNA和目的DNA虽然用不同的酶(如同尾酶)处理,但能产生相同的粘性末端,那么DNA片段之间很容易按照碱基配对关系退火,互补的碱基以氢键相结合。 在T4 DNA连接酶的作用下,其末端以磷酸二醋键相连接,成为环状DNA重组体。 由于载体DNA经一种限制性内切酶切割后,其两端的碱基序列互补,因而线性的载体 DNA可以自身环化,形成空白载体,使DNA重组体的比例下降,为目的基因的筛选带来困难。 避免的方法之一是将载体DNA在限制性内切酶切割之后,用碱性磷酸酶处理,除去s'端磷酸基。去磷酸的载体DNA不能自身环化,只能与未经碱性磷酸酶处理的外源DNA片段连接。
(二)人工接头用于处理不易连接的DNA片段
某些限制性内切酶如Hae lll 、Sma I等可产生平端(blunt end)DNA片段,机械力剪切的 DNA以及cDNA等也是平端的,这种情况采用人工合成的接头进行连接比较有效。所谓人工接头(linker)是指含有某些限制性内切酶酶切位点的寡核昔酸片段,在T4 DNA连接酶的作用下, 将接头连接到目的DNA片段的两端,然后再用相应的限制性内切酶切割,这样外源DNA片段 的两端具有了粘性末端,可以连接到用同一限制性内切酶线性化的载体上去。
(三)加入同聚物尾是处理不易连接的DNA片段的另一种有效方法
加入同聚物(homopolymer)尾是连接DNA片段的一种有效方法,在基因克隆中应用十分广 泛。将目的DNA片段用λ核酸外切酶作有限消化或者用能产生3'粘性末端的限制性内切酶(如 Pst 1)消化,生成具有3'-OH的单链末端。暴露出来的3'-OH末端是末端转移酶的良好底物,该酶可将某种单一脱氧核昔酸逐一加到3'-OH上去,生成某一脱氧核昔酸的同聚物尾。载体质粒则用能产生3'粘性末端的限制性内切酶消化生成3'粘性末端,在反应体系中加入互补的单一脱氧核昔酸,在末端转移酶的作用下产生与目的基因末端同聚物尾互补的同聚物尾,将目的DNA片段与载体混合,两种DNA分子通过互补的同聚物尾形成氢键,末端间的空隙在导人宿主菌后,可在细菌体有关酶的作用下自行修复。
（四）带有平端的DNA片段也可以连接
不同方式产生的平端DNA片段可以在T4 DNA连接酶的作用下，与某些限制性内切酶产生的平端载体相连接，但连接的效率较低。为提高连接效率，在连接这样的DNA片段时，所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末端连接要高一些。
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