DNA克隆的筛选方法及原理
重组DNA导入宿主细胞后需要进行筛选与鉴定,首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。主要包含三个步骤:首先是筛选出带有载体的克隆;然后是筛选出带有重组体的克隆;最后筛选出带有特异DNA序列的克隆。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。
(一)采用遗传学方法可筛选特定的重组DNA
1. 利用抗性标记可筛选出带有载体的细菌克隆。质粒都含有针对某种抗生素的抗性基因,转化后,将细菌放在含有这种抗 生素的培养基中培养,未被转化的细菌即被杀死,生长的细菌就是已转化的细菌。
2. 利用不同标记可筛选出带有重组体的细菌克隆带有重组DNA的克隆可利用载体的不同特性进行筛选。
(1)插入灭活法利用特定抗性基因的失活进行筛选:这种方法常被用于鉴别质粒重组体和非重组体,适用于具有两个或两个以上抗生素抗性标记的质粒。例如pBR322中 (Ampr)和 (Tetr) ,在Ampr上有Pst I位点, Tetr上有BamHI位 点,如将外源DNA通过BamHI位点插入到Tetr中,使Tetr基因灭活,再用这个重组体转化 Amp和Tet均敏感的大肠杆菌,只有在氨节青霉素平板上生长、而在四环素平板上不生长的菌落, 其携带的质粒中才可能插入了外源DNA片段。
(2)α一互补筛选是利用功能互补的基因片段:为了便于克隆外源DNA片段,在野生型M13 噬菌体DNA的N基因和E基因之间,插入了lac操纵子的调控序列以及8一半乳糖音酶前145个氨基酸的编码序列,该序列不能产生有活性的自-半乳糖昔酶。M13宿主菌(JM系列)F游离体上的8半乳糖昔酶基因中,失去了编码11----41氨基酸序列的核昔酸序列,未受感染的宿 主菌不能产生有活性的8-半乳糖音酶(lac一)。当M13的宿主菌受到M13的感染后, M13上 编码的8半乳糖昔酶的氨基端部分与宿主菌中有缺陷的合半乳糖昔酶互补,才能产生有活 性的自半乳糖昔酶,这种作用称为α一互补作用。当有lac启动子的诱导剂IPTG和该酶的人工底物X-gal存在时,产生蓝色噬菌斑。如果在M13载体上插入外源DNA片段,破坏了M13载体上lac 基因的结构,不能与宿主菌中的8一半乳糖昔酶互补,在IPTG 及X-gal存在时,则产生白色菌斑。
某些质粒载体(如pUC系列载体)也带有大肠杆菌的8半乳糖音酶基因(lac Z)前一部分片段,在lac Z基因区又另外引入了一段含多克隆位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段,在质粒被导人携带lac Z基因C端编码 区的大肠杆菌后,质粒携带的lac Z基因片段将正常表达,与 大肠杆菌的lac Z基因产物(C端部分)互补,产生有活性的自r 半乳糖音酶,加人人工底物X-gal和诱导剂IPTG后,使X-gal 转化成蓝色的代谢产物,出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点 上插入外源DNA片段,将使lac Z基因灭活,不能生成有活性 的自半乳糖昔酶,结果菌落呈现白色。由于这种颜色标志,重组克隆和非重组克隆的区分一目了然,这种筛选方法也称为 "蓝白筛选"。
Agtll也引入了大肠杆菌lac Z基因,同理,非重组体将在 含IPTG和X-gal的培养基上产生蓝色噬菌斑,而重组体则将 产生白色噬菌斑。
(二)免疫学方法是利用特异性抗体检测表达产物 如果克隆基因的表达产物是已知的,并且在菌落或噬菌斑中表达,因而可用相应的抗血清或单克隆抗体,通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。
(三) 原位分子杂交适合从基因组文库、cDNA 文库或重组质粒中筛选特定的DNA,优点：不取决于目的基因是否表达。
(四) PCR技术可对特定的DNA进行直接鉴定，对于鉴定阳性克隆十分有效,而且无需制备DNA。
(五)酶切鉴定是利用限制酶酶切图谱鉴定特定的DNA
在转化大肠杆菌并获得了一系列菌落后,可用牙签挑出单个菌落接种于2ml培养基中, 37度过夜生长。第二天小量快速提取质粒DNA,用一种或两种限制性内切酶消化质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳后,在紫外光下观察有无插入片段以及插入片段大小,判断插入方向等。限制性内切酶的选用必须根据载体和插人片段上的酶切位点来确定。
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