感谢荣誉会员exile的翻译应助！^_^
荣誉会员exile[url]http://forum.e2002.com/space-uid-85890.html[/url]为俺翻译日文专利大部份内容。
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由于exile兄弟已退役，其间欲转移威望和财富未果（kl128兄弟可以作证）！
现特请转移4威望，800财富给exile兄弟，以示感谢！对他给予的帮助不胜感激！
另附该文翻译内容，也供国内做该领域研究的兄弟提供参考：
实施例
0032
以下，用实施例和实验例来详细说明本发明。 这些例子仅仅是本发明的一部分。本发明的技术范围，不仅仅局限于这些实施例。
以下的实施例使用的PCR方法中，使用了EX-TAQ DNA聚合酶（Takara），按Robocycler Gradient 40(Stratagene)使用顺序进行。Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems) ABI373ADNA测序仪进行分析碱基序列。
实施例1 使用幼年茶植物的嫩叶调制cDNA
使用幼年茶植物的嫩叶调制cDNA按以下方法进行。
摘取幼年茶植物的嫩叶，迅速液氮中冷冻。用AGPC法提取总RNA，以逆转录酶以及系列号5中记载的Oligo dT引物（RACE32）合成cDNA。得到的cDNA溶解于Tris/EDTA，用于进行PCR。
0033
实施例2 茶氨酸合成酶基因的分离
碱基序列是在已知的谷氨酸合成酶的氨基酸序列中，以不同种属中共通的基因序列为基础，用序列号6－序列号9中记载的2组PCR引物对制成。实施例1中制成的cDNA，以序列号6和序列号8组成的第一引物对进行第一次PCR，然后用序列号7和序列号9组成的第二引物对进行第二次PCR，也就是进行Nested PCR。PCR条件：94C、30秒变性、42C30秒复性、72C1分钟延伸1个循环，共进行30个循环，最后10分钟延伸反应。用凝胶提取PCR产物，连接到Pt7Blue T-Vector(Novagen)，进行碱基序列分析。
0034
实施例3 茶氨酸合成酶基因的碱基序列测定
上述的实施例2中，得到两种茶氨酸合成酶A、B。序列号1及序列号2分别表示茶氨酸合成酶1的碱基序列及氨基酸序列。另外，序列3和序列4分别表示茶氨酸合成酶2的碱基序列及氨基酸序列。
这两个克隆如图1所示，相互间有微妙的序列差异，与其他植物由来的谷氨酸合成酶碱基序列及氨基酸水平有90％的同源性。
0035
实施例4 茶氨酸合成酶基因表达重组载体的构建
这两种克隆分别用RT-PCR扩增全长cDNA，各克隆分别连接到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)。各个克隆作为C末端含His-tag的重组酶，在大肠杆菌里异种表达的进行重组。
构建的表达载体进行DNA序列确认。
0036
实施例5 重组载体转染以及重组蛋白质的表达
实施例4构建的表达用重组载体转染到大肠杆菌BL21(DE3)pLys5中，在含有100ug/ml氨苄西林的Luria-Bertani培养基于30度培养达到吸光度为A600=0.6为止，然后添加0.4mM isoproplyl thio-b-D-glactoside，再继续于16C培养14小时。
0037
实施例6 茶氨酸合成酶的提纯
实施例5培养的大肠杆菌收集后，悬浮于含有0.1M NaCl PH=7.9的40mM磷酸钙缓冲液中,超声粉碎，15000g离心40分钟。
将上清液通过Pro-Band Ni affinity (Invitrogen)层析柱，用含有0.5M NaCl及40mM Imidazole PH=7.9的20mM磷酸钙缓冲液洗净层析柱柱，得到的重组酶溶解于含有10％glycerin及500mM Imidazole PH=7.5的15mM磷酸钙缓冲液。
0038
实施例7 茶氨酸合成酶的活性测定
实施例6提取的茶氨酸合成酶活性用下述方法测定。碳14标记的谷氨酸及ethylamine作为底物，ATP及Mg离子存在条件下孵育，测定含有碳14的Teanin，从而测出茶氨酸合成酶的活性。
图的简单说明
0039
图一 已知的植物谷氨酸合成酶和茶氨酸合成酶1、2（Clone1、2）氨基酸序列进行比较。
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