细胞免疫荧光是一项重要的实验技术。以下是我的实验步骤，可供参考。
1 细胞一定要贴在玻片上（最好可以放入24孔板），为后面照像打基础。细胞密度适中，大约60-75%满片即可，否则容易脱片。
2 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。（以下各步骤切毋使玻片干燥）
3 PBS冲洗
4 0.1%Triton作用20分钟
5 PBS冲洗
6 10%正常血清封闭10分钟
7 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗体从较高处落到片子上，以分布均匀。抗体稀释度1：60，我最常用！
8 PBS冲洗4次，各5分钟
9加入荧光二抗，室温30分钟。抗体稀释度1：400，我最常用！
10  同8。
11 90%甘油封片。也很关键阿，多封几次才有体会。
12 避光保存，或到显微镜下观察。

肺腑之言，希望能加威啊！

不知道细胞爬片有没有好办法？？

首先要保证玻片质量
1 净 如果你有钱买到已经处理好的玻片，很多工作自然可以省了。大部分人要自己处理。首先要洗一下，然后晾干，泡酸，再洗净，擦干，高压消毒，或180度烤。
2 适当包被。根据培养细胞类型选择包被材料。胶原包被后，细胞贴的更紧。
3 滴 将细胞悬液滴到玻片上，不要让培养液溢出玻片，待细胞贴壁后，加足培养液。这样可以避免玻片两面都有细胞。滴多少要自己摸索一下。

大家都来说一下自己的体会吧

说说我的意见
1 封闭一般用10%羊血清，时间可从半小时到一小时不等。
2 一抗和二抗的浓度没有固定的说法，可以先根据已有文献的用法。最后还是要靠自己的摸索，也就是自己要试试不同浓度，总结归纳选择适合自己试验的浓度。
3 二抗一般情况，常温下孵育时间1-2小时，当然我前面说了，也要自己先摸索。
4 有时候为了增强反应，可在一抗甚至二抗中加入triton-x100,浓度也有从0.01-0.2%不等各种用法。当然这里有个问题，使用过triton-x100的人知道，它容易使液体流失，所以如果要使用的话，最好买像pap pen这种笔，在玻片上画圈筑堤，防止抗体流失，同时可以减少抗体用量。
5 另外pbs冲洗要充分，否则背景染色会很强。

嘿嘿,我也凑个热闹!
1. 在细胞免疫荧光中，triton-X100的作用非常关键，其主要起到透膜的作用，其可破细胞膜和核膜，对于核阳性的，其作用时间可达30分钟，并且就像exile斑竹说的那样可在PBS甚至一抗中加入triton；如果为浆阳性，triton作用时间需适当缩短；
2. 封闭液我们常用2%的牛血清白蛋白，这样可以减少2抗产生的交叉反应；
3. 加一抗前，我们都是把盖玻片放在缠上一圈封口膜的载玻片上，这样可以节省抗体，并且可使抗体充分作用；
4. 对于一抗的浓度，我们都是在做预实验时按不同比例试验，个人认为一抗的浓度绝对要摸索，不同指标，不同厂家的抗体，甚至同一厂家不同时期的抗体其浓度有可能都不同；
5. 一般在实验时，我们都要加阳性对照和阴性对照，表面看起来还挺麻烦，但实际上一旦出现什么问题，对分析实验失败的原因有很大帮助

一家之言，望不吝指教！

谢谢jiaqiang_t和大家分享自己的经验，这里我再补充几点自己的经验
1 关于triton x-100,对于培养细胞的免疫染色，使用浓度一定要小心，一般浓度不宜过高，我有一次根据文献在封闭液中用到0.5%，结果细胞大部分脱落。所以，不同的培养皿和不同的细胞使用triton时浓度需要调整。
2 上次我提到的pap笔，其实一般用于组织切片染色。正如jiaqiang_t提到的，为了节约抗体，可以把盖玻片盖在细胞上面，我用的方法和jiaqiang_t大同小异，我是用两层橡胶皮粘在一起，剪成大概0.5mm 宽，6mm长，在盖玻片两端对称贴上，然后橡皮条一侧朝细胞面放置，3厘米培养皿一般120微升抗体就可以了，大家在具体使用之前可以先用水试试需要多少容积。还有，大家可以买那种圆形的盖玻片，用起来更好。
3 封闭液构成也不是一成不变的，可以根据情况自由选择，其实我用5% goat serum +2%bsa比较多。
欢迎大家继续讨论！

学到很多东西！

10%的正常血清封闭10min中的正常血清一般使用什么血清?

hao [s:90] [s:90] [s:90] [s:90]

不明白，我的财富: -63 鸭币
为啥变成-６３？ [s:123] [s:123] [s:123]

引用:

引用第10楼qhdx95于2008-01-18 08:28发表的 :
不明白，我的财富: -63 鸭币
为啥变成-６３？ [s:123] [s:123] [s:123]

兄弟可能是发了广告帖或者恶意灌水的帖子吧
我们鸭鸭的版主可是非常勤快的
一经发现
马上处理的

呵呵,来学习下.....看看....是啥好东西

[s:90] [s:90] [s:90]

不知道细胞爬片有没有好办法？？