1、设计引物首先以“引物设计原则”为据，但也不能一成不变。具体问题要具体分析。
2,选择自己熟悉的软件，primer3，5；或者DNAstar等等，根据特殊情况可能需要其他的特有软件。3、重点考虑5端和3端引物的退火温度大致相当，GC含量等次考虑之。
4、尽量避免多的二聚体和发夹结构的存在，当然，在设计用于表达的引物时加入酶切位点，肯定会使二聚体的产生几率增加，这也无可避免。不要顾虑太多。有时为了节省钱，偶经常在一条引物上设计上2－3个酶切位点，当然这么多酶切位点导致引物自身容易产生二聚体，但是只要引物序列与模板序列特异性较好，这些都不成问题。
5、偶经常用primer5设计后，再用OLIGO分析各项指标，尽量使设计的引物各项指标与引物设计原则的要求不会偏离太远。偶也用DNAman来分析两条引物之间可能会形成的二聚体等，最后用在线的软件
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html作进一步校验。
6、完成上述几步，引物就设计完成，然后送去合成。
当然，如果批量设计引物，有专门的软件，经常用的一款是
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_[url]www.cgi[/url]。
最后,初做设计时,不要依赖软件,一般不要一开始就用primer等软件自动搜索,容易产生误差
以上拙见，希望能对大家有用
