第三节 大体标本的处理和固定
解剖所得的脏器标本，可提供临床病理讨论及教学和科研之用，除对有典型的病变脏器制成标本外，对有重要病变的脏器亦应固定保存，条件允许可将全部脏器切成需要的大小保留。
通常所用的固定液是10%甲醛（即福尔马林）水溶液（市售甲醛溶液用水稀释1：9）。这样既可使组织内的蛋白和脂类等成分凝固，又可使组织不致腐烂。为了保存组织内的各种水溶性成分、如粘液、肝淀粉和尿酸盐结晶等，应在剖验当时将部分脏器切成组织块放入纯酒精液固定，切不可着水。
只有细心且有计划地进行尸体剖检，并在切除器官后仔细处理才能获得良好地陈列标本。剖检过程中的粗心和草率，很容易破坏一个有价值的标本。因为今天的常见病明天会成为罕见病例，为此重要的是保持这些病理标本原有的形态和色泽。有时外科手术摘除的标本，如经适当处理也可以成为最好的陈列标本。
常规的福尔马林固定后，大体标本常呈灰褐色，用下述方法拟可保存大体标本的色泽，使之更接近自然色彩。
配方：甲醛 20ml
硝酸钾 3g
醋酸钾 3g
生理盐水 加至 100ml
固定时间视标本的大小而定，一般24－72小时。固定后经充分的流水冲洗后再放入下述保存液中长期保存。
甘油 20ml
醋酸钾 4g
麝香草酚 0.2g
蒸馏水 加至 100ml（PH＝8）
第四节 陈列标本的固定
一.为供日后临床病理讨论、教学和研究用的标本，必须将有关主要病变的脏器和其它继发变化的脏器一并保留，这样就保持了各脏器病变的联系性和整体性。
二.将每一尸体的内脏放入一个较大的玻璃缸内。这种园缸应有紧密的玻璃盖，使之不漏气。缸内先装半缸10%甲醛液，再将需要保留的各脏器放入，一定要浸在固定剂内，若听任露在液面外的组织变干，则会造成一块永久的暗色区。
三.各标本如肝、脾和肾等应具有一光滑平整地切面（须以锋利的长刃刀一次切出）。轻放在缸内，以免弯曲变形，缸内切不可多装标本，特别是新鲜的软标本和对有教学价值的标本要分别固定，以免挤压、防止固定不足和变形而失去原有的特征。缸内固定液的量是标本体积的4－5倍。一般实质性脏器制作标本时，其厚度宜在1.5厘米左右，过厚则固定液不易渗透入内，过薄则易变形翘起。
四.肺脏标本比重较轻，易漂浮在液面，可用薄层脱脂棉花覆盖其表面、借以棉花纤维的虹吸现象，可不断地浸湿标本。在有条件的情况下，为保证充分固定，应尽可能向标本内灌注固定剂。
五.标本放入固定液12小时后应加以翻转，以使标本与缸底或缸壁接触部分能很好浸透固定液。
六.具有空腔的脏器（如大、小肠）膜组织（如胸膜、腹膜等），皮肤等则应在剪开后用扣针将其边沿钉在硬纸板上，标本朝下浸到固定液内，以保持病变的形态，使用的扣针需防锈（也可用玻璃，竹签或不锈钢针）以免污染标本。
七.囊腔组织如果没有打开可用注射器注入固定液使之充盈；如已打开则需填入浸有固定剂的脱脂棉以保持其自然状态。
八.被胆汁污染或含胆汁的标本，必须分别固定贮存，否则会污染别的标本。
九.标本的外观、标签和目录也同样重要，大体标本的编号最好用布条，用碳素墨水书写解剖号码，然后将布条浸渍溶化的石蜡，冷却后将标签系于标本上或投入缸内，标本缸外面亦须贴上解剖号码，以便随时取验。
十.大体标本的保存和管理必须予以重视，应定期加入甲醛溶液以补充平时之挥发。液体内混和少量麝香草酚，作为防霉剂。平时也勤加管理，以防止发霉和标本腐烂。除有明确病变需要保留的标本外，对废旧标本亦须妥善处理。一般相隔3－6个月后，集中装于草包内焚化或深埋。
第五节 脱 钙
组织里存有钙盐可妨碍用常规方法制作良好切片。骨组织及钙化病灶，经过固定后，必先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片。如脱钙不全则切片易撕开或碎裂并损伤切片刀刃。脱去钙盐的过程――称为脱钙。脱钙时应注意：
1.骨组织固定24小时后，锯下不超过0.5mm厚的薄骨片，再以10%福尔马林固定后进行脱钙。（未固定的组织在酸性脱钙液中受到的损伤比已固定的组织约大三倍）。骨组织过厚则需延长脱钙时间，长时间浸于强酸影响切片染色效果。
2.在不影响诊断的条件下，应将骨组织周围的软组织全部剥去。如果切片目的在于观察骨髓病变或骨组织肿瘤，最好除去一部分正常的致密的骨组织，以利于脱钙和制片。
3.脱钙前最好先将骨组织进行脱脂。
4.脱钙要彻底，脱水应充分，在脱水过程中，要注意不使其过度硬化。
脱钙剂
优质脱钙剂的标准是：
（a） 完全脱钙。
（b） 不损伤组织细胞或纤维。
（c） 不妨碍以后的染色技术。
（d） 适当的脱钙速度。
一、强酸脱钙剂
1.含甲酸脱钙液
Gooding和Stewart氏液（甲酸－福尔马林液）
配方：甲酸 5－25ml
福尔马林 5ml
蒸馏水 加至 100ml
5%的甲酸是一种良好的常规脱钙剂，速度适当，组织损害小。当甲酸成分增至25%则增快脱钙速度，加入甲醛可适当保护组织不受酸损害，但应切记，增加脱钙速度只能靠牺牲细胞微细构造来获得。
根据组织的厚度和钙化程度，在5％甲酸液内2－4天可完全脱钙，横切的肋骨需36－48小时。
2.含盐酸脱钙液
Von Ebner氏液
配方：浓盐酸 15ml
氯化钠 7.5ml
蒸馏水 加至 100ml
盐酸脱钙易使组织收缩，作用速度较快，用氯化钠作为溶剂则效果良好，牙齿脱钙时盐酸可增至10－20%。脱钙时，每日应加盐酸（0.5%）直至完成脱钙，横切的人肋骨（5毫米厚度）于36－72小时内脱钙。
3． 硝酸脱钙液
是最常用的脱钙剂，用硝酸作脱钙液的缺点是形成亚硝酸而使溶液呈黄色，产生颜色即迅速影响脱钙速度，且组织的黄染会妨碍随后的染色反应。在硝酸内加入0.1％尿素可以防止变黄而使之无色，但尿素仅有暂时作用，一旦硝酸显淡黄时需要加入。
福尔马林－硝酸液（Clayden氏液）
配方：福尔马林 5ml
硝酸（比重1.41） 7.5－15ml
蒸馏水 加至 100ml
此处方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸软作用，这即具有脱钙作用，又具有固定作用，硝酸脱钙迅速，组织不膨胀，掌握好脱钙时间可直接脱水，不影响染色效果。但最好先洗去硝酸。
横切人肋骨（5mm）用含7.5％硝酸液于1－2天内脱钙。
硝酸水溶液
配方：硝酸（用0.1尿素稳定） 5－10ml
蒸馏水 加至 100ml
此液用作常规脱钙剂，作用迅速，对组织不膨胀，对细胞的保存和染色比前者更好，能适用多种染色技术，但每日需要更换新鲜溶液，最好早晚各一次，一般1－3天完成。
横切人肋骨（5mm）在12－24小时内脱钙。
二、螯合剂脱钙
乙二胺四乙酸（EDTA）是用以脱钙地螯合剂。为有机化合物，有结合某些金属的能力，能结合钙盐，15%的溶液即起脱钙作用，组织用此方法脱钙，对组织破坏性小，即放置数月亦不致引起对组织的破坏，对以后大多数的染色技术皆可得到满意结果。
经10%中性福尔马林盐固定后，将组织移到50倍用磷酸盐缓冲剂缓冲至PH值等于7的5.5％EDTA内。
不超过5毫米厚度的小块组织在此液内每4－5天换液一次，更换三次后再每天换液一次以便较准确的确定脱钙终点。脱钙“终点”可用X射线方法或用草酸盐化学方法。
完全脱钙后将组织直接移到70%酒精内常规脱水，浸蜡，石蜡或火棉胶包埋。
三、脱钙步骤
1．取材：骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片。
2．固定：再以10%福尔马林固定2天。
3．将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。
4．流水冲洗24小时（除酸）。
5．进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。
四、鉴定脱钙是否彻底
确定脱钙“终点”三种方法：
1. 最常用的是最简单的方法――针刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力时，说明组织基本上脱钙完全，否则应继续脱钙。靠组织的柔软性测验脱钙作用靠不住，而且这种插入一根针以察觉钙沉淀的方法会造成组织损伤。
2．用X射线检查：看组织内是否仍有钙质。
3．用化学实验检查：
取5ml脱钙液用2M的NaOH（氢氧化钠）调整至中性，再加5％草酸钠或草酸铵1ml，液体混浊表示有钙质。迟至5分钟仍不混浊表示脱钙液中不含有钙质。
组织中仍有钙质时，一定量的钙离子会溶于脱钙液中，游离的钙会干扰脱钙作用的完成。显然，应在每次试验时完全更换，再试验中必须经过2－3小时间隔让钙溶解。
五．酸的中和
脱钙后水洗24小时，目的是除去组织中经无机酸浸渍后过多的酸，以免影响染色。再冲洗前应将组织用一种碱处理以使之脱酸呈中性，可用5％硫酸钾或硫酸钠处理过夜。（否则会引起组织膨胀）但直接转移到稀酒精（70％）内过12－18小时换液2次，再继续脱水，经无水酒精，氯仿透明，石蜡包埋，切片，整个过程其酸已全部除去，在多数情况下不仅不膨胀且对染色反应能有所改善。因此不冲洗对染色也没大碍，只是脱水剂被酸化。
第六节 组织的冲洗
组织经过固定后，脱水之前应进行冲洗，将组织内的固定液洗干净，否则残留组织内的固定液有碍制片和染色，而有些固定液则可在组织中继续起到脆化组织的作用，以至于损坏组织，给制片工作带来不利。在冲洗时，冲洗剂的选择应依固定液的种类和性质而有所不同。
冲洗时应注意以下事项：
1. 水溶性的固定剂：需用流水冲洗。
2. 酒精溶剂的固定剂：应用同浓度的酒精浸洗。
3. 含苦味酸的固定剂：（苦味酸与甲醛混合液除外），须用70％酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。
4. 含有升汞固定剂：组织经固定后应在冲洗剂－水或酒精中加碘以洗去组织内汞的沉淀。
5. 含有铬酸的固定剂：组织在冲洗时最好置于暗处，以免产生沉淀或使组织硬化而影响制片。
第二章 石蜡包埋技术
制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节 脱 水
脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一． 常用的脱水剂
1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。脱水时间应视组织种类，组织块大小，厚薄和固定剂的不同而异。如脱钙的骨组织，实质性脏器等的脱水过程宜短，而疏松结缔组织，脂肪组织等，脱水过程则宜适当延长。水分必须脱干净，脂肪必须溶去。含有铬酸的固定剂固定的组织，脱水时间不宜过长，而镀银组织更应注意，脱水时间应比为镀银的同类组织要短。
脱水的基本原则：从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精，以保持组织中的水分完全脱净。一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织,脱水全过程仅需要数小时即可达到完全脱水。在各级浓度酒精内处理的最短时间分别减少到2—4小时也能获得满意的结果。如果组织脱水不尽,随后的透明,浸蜡都会受到影响,致使切片很难以完成。较差质量的切片,很容易造成在染色时脱片,这样的组织蜡块，因其含有一定的水分,一经与空气接触即干燥而凹陷。脱水不尽的组织是不能切出很好的切片的。
外检标本的制作,目前都采用快速脱水的方法。科研标本,教学标本的脱水时间比较长,其目的在于更充分脱水,并适当加强了组织的硬度。
酒精脱水剂使用不宜太久,应适时更换新液。当酒精混浊,变黄或酒精滴于水中出现乳白色混浊时,说明酒精中溶解了过量的脂类,这种情况一出现,将会影响脱水,则应及时更换。
各种浓度酒精的配制：
切片室内应常备有70%,80%,85%等各种浓度的酒精。配制时应以95%酒精作为基液加水稀释,不要用无水酒精去配制,因无水酒精的价格较高,极不经济。
配制方法如下：
1．先将高浓度酒精注入量杯，其量同将要稀释酒精浓度数字相等。
2．加入蒸馏水，致总量达到原酒精浓度的数字量。例如：
(一)用95%酒精配制成70%酒精时：
(1)取95%酒精70毫升；
(2)加蒸馏水使达到95毫升；
稀释后的酒精既为70%的酒精。
(二) 用80%酒精配制成60%酒精时：
(1)取80%酒精60毫升；
(2)加蒸馏水使达到80毫升；
稀释后的酒精既为浓度为60%的酒精.其余类推,其他的试剂的稀释也均可以参照此方法进行配制。
2.丙酮(Acetone)：可用作固定液,也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强、速度快,可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下,多用在无水酒精的补充脱水。
丙酮脱水时间比酒精强,但容易使组织过度硬化,所以应适当掌握脱水时间。
3.正丁醇(γ-Buty alcohol)：正丁醇脱水能力较酒精弱,可与水、酒精相混合,而且也能溶解石蜡,因此正丁醇不仅可以替代酒精使组织脱水,还可以代替二甲苯使组织透明。平常在稀释时都与酒精按照一定比例配制使用,或将组织脱水至90%酒精后移入正丁醇, 正丁醇再脱水后可直接投入石蜡。用正丁醇脱水,组织比较少引起收缩和硬化等不良结果。
4.二氧乙环(Dioxan)：二氧乙环是一种有毒物质,易挥发(使用场所必须通风),能同水、酒精、二甲苯相混合并能溶解石蜡,是一种既可以脱水,也具有透明效果的液体。脱水一般可以70%开始,再经过90%至纯二氧乙环,然后浸入石蜡。二氧乙环脱水对组织无收缩和硬化等不良现象,对较硬的组织或易收缩的组织可使用二氧乙环。
二.组织的摇震
为加快脱水进程可将标本放入各级酒精内借助机器或手工震摇，还可以加温促进脱水。即将标本装在塞紧的玻璃瓶置于包埋箱或温箱内，因液体受热产生的正压可增加溶液的对流。但热酒精会使组织过硬，并有爆裂危险，除急诊外，最好不用此方法。
第二节 透 明
组织脱水后，还要经过一个浸蜡的媒剂透明过程。目的是使石蜡渗透到组织中去，达到包埋的支持作用。常用的脱水剂如酒精等，不能溶解石蜡与之相混合，因此必须使用一种既可以同酒精又能同石蜡相混合的媒剂，当组织脱水后，浸蜡之前将组织投入这种媒剂中。由于两剂能相混合，另一方面也由于这种媒剂比酒精比重大，组织中的酒精就被该媒剂取代，待酒精完全被该媒剂完全取代后，组织即成透明状态，因此我们长称这种媒剂为透明剂，在制片中的这一过程就称为透明过程。实质上透明仅是一种过程而非目的，其所以出现透明现象使因其折光系数改变的缘故。从组织的状态上看，由于组织经过媒剂的作用之后，其折射系数近于组织蛋白的折射系数，从而显示出透明状态。组织一旦呈现透明状态，也说明脱水剂已被媒剂所取代。透明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡。
透明剂
透明剂很多，一般常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等。
1．二甲苯：是最为常用的一种透明剂，它能与酒精，丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。在透明过程中，组织继续发生硬化，由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，因此，组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，一般是达到组织的透明为度，小块组织在半至一小时内透明。为了不使组织过度硬化，苯则。是更好的一种透明剂，它较甲苯和二甲苯的作用稍缓，对组织收缩较少，不易变脆。但苯较二甲苯毒性大，挥发快，故应注意安全使用。
2．氯仿：也是一种很好的媒剂，它的作用缓和。组织在此液内过夜也不至于过硬变脆，这一点较苯，二甲苯和甲苯优良。但氯仿比重较大，折光率较小，不能改变组织的折光率，组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象，所以组织要比实际需要浸渍更长一些时间保证完全渗透和置换出酒精。
3．香柏油：是研究处理细柔组织的最佳透明剂，因它的硬化作用极小，组织在此液体内较长时间甚至几个月也可无妨。过硬的组织脱水后，（如皮肤和致密纤维组织）用香柏油透明，经此处理后的组织容易切片。不过香柏油的浓度大，渗透力弱，同石蜡混合不及其他透明剂效果好，故常规石蜡切片一般不用。
透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织，就应该缩短在二甲苯内留置时间，而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时间，最好先投入酒精和透明剂等量混合液半小时，再入透明剂，并更换一次透明剂，待组织完全透明后进行浸蜡，一般需要半小时至2－－3小时。
脂肪组织由于其结构不同透明最快，但是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透明剂取代，因脂肪组织本身折光率与透明剂（二甲苯）相近，所以应在透明剂中多浸一段时间使脂肪组织尽可能为透明剂所溶解，才有利于石蜡的侵入。
透明过久是否会导致组织过度硬化变脆，这取决于脱水的彻底与否，如果组织脱水完全彻底，则不会导致过度硬化和变脆，个别含胶样物质过多的组织例外。
第三节 浸 蜡
组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点，浸蜡需要能够保持于54－60.C温箱内进行。石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关，因此对石蜡的选择应以注意。
用作浸蜡的石蜡不应含有尘粒，杂质及其他异物，不含水分，质地均匀成半透明状，触之感觉滑而不腻，结晶及颗粒少。石蜡中如有水分会结晶而变为白斑可用加热搅拌的方法除去。所有的蜡在使用前按常规必须用标准滤纸在漏斗内过滤到搪瓷杯里储存于浸蜡箱中。最好将石蜡于小锅中加热煮至近沸，冷却再煮反复数次后空气可以排除，挥发性油脂类在煮的过程中挥发。处置后的石蜡置于恒温箱中保持液体状态备用。所用的石蜡有一定的熔点和硬度，熔点高，硬度大。一般要求在52－56℃之间，这既可以支持硬组织也可使切片成条。使用时应根据组织类型以及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡，冬季则采用低熔点的石蜡。
石蜡的熔点越低，其质地相应的较为疏松。硬蜡（熔点60℃）用于硬纤维组织。软蜡用于胎儿和乳腺组织，这些尽为研究工作的需要。为了增加石蜡的韧性，可在石蜡中加入一些混合剂，常用蜂蜡，硬脂酸，松香等。
1.蜂蜡：又叫黄蜡，是蜜蜂用来造巢的淡黄色蜡，熔点在54℃左右，质地柔软，滑润有韧性。为了使低熔点的石蜡硬一些，可加入10－20％的蜂蜡。它能增加蜡的熔点而不必使组织浸在高温内，便于切片。也要根据组织的种类而异，一般常规用量不超过5％为度。
2.硬脂酸：为有光泽的白色片状结晶体，不溶于水，而溶于乙醇，醚和氯仿。熔点64－71％，在浸蜡中加入少量的硬脂酸可增加石蜡的渗透性。有人用硬脂酸和石蜡混合液置于温箱中代替二甲苯透明。
3.松香：为棕黄色半透明的固体。质硬而脆，遇热熔解，呈胶体状，同石蜡混合时，可增加石蜡的硬度，由于松香质脆，混合后可增加硬度但韧性不足。
组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异。在整个浸蜡过程中，标本大小对完成浸蜡所需的时间有很大影响。较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中心，而且厚的组织常带入的透明剂比较多，故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。即使少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶，致使切片时切片易碎裂。也要考虑组织的种类，骨，皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍时间。含血多的组织，肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆，故浸蜡时间应缩短。疏松组织，脂肪，消化道组织等浸蜡时间可以适当延长一些。为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。浸蜡时间1－4小时，或更长，并使之过夜则较易切割，如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和龟裂。
第四节 包 埋
包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后，进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。
一． 石蜡包埋法
石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法，它有许多优点，操作简易便于掌握，可进行连续切片，包埋后的组织可以长期保存。
包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下：
1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
二． 石蜡包埋的注意事项
1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择，而且与组织的硬度也有密切关系，过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋，反之，软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。
2.包埋用石蜡加温不可过高，以保持其不凝固为度，温度过高容易将组织烫坏，使得组织变硬，变脆，并发生卷曲，收缩变形而不利于切片，甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度，两者是否合适，温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象，而达不到包埋的作用。
3.包埋用石蜡应掌握用量，以组织全部包埋完毕，石蜡也恰好用完为宜。
4.包埋应注意组织病变面放在下面，并尽可能使组织放平，在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。
5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位，应将组织块直立拉平，不要卷曲。
6.相同组织如包埋于一个蜡块时，除包平外，还要注意方向的一致，以利切片。
7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时，组织的排列一定要密挤靠拢，以求成直线或方块行，这样有利于切片。
8.石蜡包埋后，不宜冷凝过慢，特别是室温较高时，石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度，韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。
三． 石蜡包埋程序
1. 组织取材2毫米厚度，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小时。
2. 组织流水冲洗6－12小时。
3. 70％酒精2－4小时。
4. 85％酒精2－4小时。
5. 95％酒精（Ⅰ）2－4小时。
6. 95％酒精（Ⅱ）2－4小时。
7. 100％酒精（Ⅰ）2－4小时。
8. 100％酒精（Ⅱ）2小时。
9. 二甲苯（Ⅰ）0.5－1小时。
10. 二甲苯（Ⅱ）0.5小时。
11. 浸蜡（Ⅰ）2小时。
12. 浸蜡（Ⅱ）2小时。
13. 组织包埋。
在实际操作中，各级酒精脱水的时间可以因组织的大小，多少而减少或延长，如要在酒精中过夜最好是在低浓度酒精中浸泡，透明过程一定适当掌握，不要时间过长。更换脱水酒精，如从节约的角度考虑，可将各级酒精逐级下降使用，如无水酒精可降为95％酒精在继续使用。应考虑到组织在酒精中脱水过程里，除去组织中的水分混入酒精，使其浓度降低外，组织中的一些可溶物质，如脂类也可被酒精溶解，酒精中含有一定这样的物质时，将会降低脱水功效，因此，最好是更换酒精。
组织脱水，透明彻底后，浸蜡过程在必要时候可以延长，例如，在石蜡中过夜，但温箱一定要恒温，以免组织块受高温影响，造成组织过度硬化。
四.快速石蜡包埋法
快速切片诊断是在数十分中或半小时左右制成切片并作出诊断的一种手段，主要用于手术中决定手术的切除范围和手术方式。快速切片的方法包括冰冻切片和快速石蜡切片。
制作快速石蜡切片时，切取组织应该薄小，从固定、脱水到浸蜡的全过程都要加温，一般是先将各种试剂在超声波快速石蜡脱水仪中预热，恒温下操作，整个过程大约在10－15分钟即可完成。
操作过程：
（1） 先取病变组织于AAF中固定3－5分钟。
（2） 95％酒精1分钟。
（3） 无水酒精1分钟
（4） 正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分钟
（5） 二甲苯1分钟
（6） 浸蜡1－2分钟
（7） 包埋，将组织置于预先备置的蜡块中（固体石蜡包埋法）;预备一硬蜡块，用热镊子于蜡块中间熔蜡一小部分，在以热镊子从蜡杯内取出已与石蜡饱和之组织块投入融蜡中，冷固后，立即进行石蜡切片。石蜡切片附贴后，在火上稍加烘烤使组织切片上石蜡全部熔化，水分也被烘干，然后投入二甲苯，100％酒精，95％酒精各30秒脱蜡，入水冲洗，常规苏木素，伊红染色。
第三章 切片技术
优良的切片技术取决于所有器械的透彻了解和丰富的实践经验。实验工作的每一方面都需熟练的技巧，这只有靠实践才能获得。早期练习如草率和不当，多年后还会反映出来：但要是达到了训练的高标准，以后就会一直保持下去。经良好训练和实践的技术工作者能在很短时间内制出第一流的切片。
第一节 切片刀
切片刀或许是切制良好切片的最主要因素，因为它较之切片机而言造成切片不良的机会最多。只有刀口无损，才能切制完整切片，如切片刀不够锋利、切片时会自行卷起或皱起，更不能顺利地将切片切成连续地长条带状，破碎、不完整。所以，锋利和调节良好的切片刀使切片易于操作。如可能，每人应有自己的刀，并自己保管，不仅能精心保护且因每个人操作习惯不同而利于使用。
一、切片刀的种类
根据切片刀的结构式样区分的主要有以下几种：
(a) (b) (c) (d)
a平凹形 b深平凹形； c平楔形； d双凹形
二、切片刀的选择
平凹形：用于滑动式切片机或某些轮转式切片机。
深平凹形：仅用于火棉胶切片，因为刀口较薄，用其切制硬固材料时刀叶会颤动。
平楔形：用于普通石蜡切片和巨检标本切片。
双凹形：用于摇动式切片机和滑动式切片机切割石蜡切片。
三、磨刀
理想的切片刀的刀刃应在两个平坦切割面间形成笔直细线。一把锋利的切片刀能将石蜡切片切到2微米并连续成条而无压缩。如果刀刃比细胞还厚，则它对细胞的破坏要比切割的大。因此，磨刀是从事切片技术的一项基本技能，必须锻炼和掌握。
磨石种类很多；有天然、人工或平板玻璃。天然磨石：宜仔细选用质地纯净无杂质并较硬的砚石，稍软而涩的用作“粗磨”；硬而细滑的用作“细磨”。
工业用金钢砂磨石；有多种规格和级度，细度均匀，一般多将最细的金钢砂磨在组织学上做“粗磨”，用以磨去损伤较重的切片刀刃上的较大缺口。
平板玻璃：裁取适当大小作磨石用，须在磨石面上加氧化铅等磨料，如普通磨石同样方法使用，优点是变换不同细度的磨粉或磨浆，可在一块玻板上作“粗磨”，“中磨”或“细磨”用。
磨刀石的大小可根据切片刀大小种类而异，磨刀时需加稀润滑油，肥皂水或水，用油较好，磨石用过后须拭掉磨料和小金属屑。最好是磨石固定装在一只盒内，磨石周围有刻槽便于排流多余的油和水。使用完毕立刻盖上盒盖以防落上污物或灰尘。如未除去这种灰尘会损伤石面并在砥磨时使刀刃发生缺损。
四、磨刀方法
磨刀的手法各人有所不同，但有一个原则，必须将刀口全部磨到，使其平衡一致。同时还要保持磨刀的平度。切片的中部使用较多，耗损也较大，磨刀时应照顾到它的平衡，以免使用日久后刀口形成月牙状，影响切片质量。
磨石的方法包括手工磨刀和磨刀机自动磨刀，本节着重介绍手工磨刀的具体方法，机器自动磨刀应在仔细阅读使用说明后按操作程序执行。
磨刀的步骤：
1、将磨刀放在一条粗面（或铺一层湿布）实验台上使在砥磨时不会活动。
2、在磨石面中央滴入少量的稀润滑油或液体石蜡并均匀抹开，以便增加磨擦密度。
3、将刀柄和刀夹装在切片刀上使刀刃向前，平放在磨石面上，刀跟大致位于磨石的中央。
4、砥磨时手指应保持正确位置以使用力均匀易于滑动，以右手握住刀柄，左手握住刀壳，刀刃朝向磨刀者前方，将切片刀从磨石的右下角刀端向磨石的左上角向前斜推进至刀跟，将刀刃从上面翻转；翻转时刀夹不能离石，此时刀刃向着磨刀者。将刀横向移动使刀跟的刀刃处于磨石前端的中心，再斜着拉回。此时再将刀刃从上面翻且将刀横向移动使切片刀在磨面上处于原来的位置。（见图解）这样每完成一次要有八个动作，切片刀应与磨石全部接触到，反复进行。砥磨时左右手均匀压迫整个刀刃，避免倾斜，并要防止油腻的手指从刀面滑开。
由于手法的习惯不同，也可以从磨石的左上角向右下角推进，翻转后再从左下角向右上角拉回，只要将刀与磨石全部磨到，这是没有什么区别的，简便快捷的方法也同样有效。熟练后可使动作速度加快和将刀刃磨利，但在练习中过早地追求速度会将刀刃磨钝或割破手指。
5、上述过程持续到磨掉缺口，对损伤较大的切片刀须用粗细两种磨石，在粗磨石上磨掉大缺口，再在细磨石上磨锋利。
向前推进式磨刀法，磨擦较快，效率较高，大约一把迟钝的切片刀只需要20分钟左右就磨锋利。然后即可准备鐾刀。
五、鐾刀
鐾刀是将已磨快了的刀刃鐾使锋利更加致密。最好的鐾刀皮是用马臀部皮肤制成的，叫“马革鐾刀皮”。分两种类型（1）能弯曲的（手持的）。（2）绷紧的。所有鐾刀皮的类型依个人爱好而定。像磨刀石一样，鐾刀皮面须无污物和灰尘。
鐾刀的方法：
手握刀柄，不用刀壳，以刀背在鐾刀带上后退式的向上移动（就是说与磨刀的方向相反），反转后再以刀背后退式向下拉回。反复这个动作进行磨鐾，一般3—5分钟即可。其鐾刀技术动作完全与磨刀相反，练习使用鐾刀皮的全部长度均匀地鐾完整个刀叶。在每次鐾到头时须练习如何翻刀以免切到鐾刀皮上。
检查切片刀是否锋利，通常以手指轻轻试摸刀口的锋刃，如果感到好像一排极其细密针刺的触觉，说明刀口已锋利。如用放大100倍显微镜下观察，可见刀口表现一种非常细的断续线，如一排极其细密而又均匀的锯齿，即所谓锋芒。如果没有出现，仍须再磨。
磨刀和鐾刀的方法图解（略）
切片刀磨好后应细心爱护。切片刀平时放在刀盒内，不要任意放在实验台上，不要用它切制明显钙化的组织，这样,切片刀锋利的刀刃就不会轻易的被损坏了。
第二节 切片机
切片机是切制薄而均匀组织片的机械，组织用坚硬的石蜡或其他物质支持，每切一次借切片厚度器自动向前（向刀的方向）推进所需距离，厚度器的梯度通常为1微米。切制石蜡包埋的组织时，由于与前一张切片的蜡边粘着，而制成多张切片的切片条。
切片机的基本类型的五种，按其结构叫做（1）摇动式切片机，（2）轮转式切片机，（3）滑动式切片机，（4）推动式（雪橇式）切片机，（5）冰冻切片机。普通最常用的是轮转式切片机。
轮转式切片机：
系借转动手摇轮进行切片动作。蜡块台镶装于可在沟槽内上下运动的金属夹座中，借微动螺旋向前推进切断平整的切片。有的转轮式切片机的机头上装有三只旋钮和一个紧固旋钮能使其向各个方向偏转并紧固，便于调整蜡块的切面。切片刀的切制角度可以调整（切片刀倾斜）。由于这种切片机上使用的是一种重而大的切片刀，故除切制硬组织时一般不发生颤动。切片厚度借旋钮可以1—30微米之间调至任何厚度，每一梯度为1或2微米。
轮转式切片机的优点是机体较重，故此摇动式切片机稳定，非常适于切制石蜡切片，可以理想的切制连续切片，亦用以切制大组织块。
第三节 石蜡切片的制作
以石蜡制作的切片，可以制成极薄的切片。一般的切片厚度要求在4—6微米。而石蜡切片不但可以达到这个要求，甚至可以切得更薄到2微米以至1微米。这一点是冰冻切片和火棉胶切片难以获得的结果。另外，石蜡切片还便于制作大批的或是连续的切片。而且以石蜡包埋的组织块便于长期保存。所以石蜡切片是目前各种切片制作方法中最普通常用的一种方法。
一、 切片前的准备：
1、恒温水浴锅首先预热至35℃—40℃。
2、蜡块整修，将蜡块组织面的石蜡用刀修去，使组织全部暴露出切面并修平，以减少切片刀的磨损。将组织块左右两侧的石蜡在不损伤组织及影响诊断的原则上，全部切除；否则切片容易皱褶。组织块上下边缘的石蜡视组织情况修齐修平；石蜡不须留得过多，应尽量少留，以保持组织间距的最小限度。这样切下的切片既呈带状，也不弯曲。片距小，在贴片时就可相应多贴片，有利于检查诊断。修切蜡块时只能一点一点地切掉蜡边，要是大片修切易使蜡块断裂露出组织；遇此情况应返入新蜡再次包埋。
3．载玻片应事先洗涤干净，无油腻和不透明现象，应将载玻片浸入酸缸内12小时后流水冲洗，再烤干备用。根据切片需要张数，每片涂上一层极薄的蛋白甘油，插于载片板（或载片架）上备用。
蛋白甘油的配制：取新鲜鸡蛋1份加甘油1份再加适量麝香草酚搅匀。此法主要是防止脱片，实际上一张很清洁的载玻片不涂蛋白甘油也不会脱片。
4、将锋利的刀片装入切片刀夹钳内，调整角度和位置后随即紧固，检查切片刀的倾斜度是否正确，倾角过大、则切片上卷；倾角过小则切片皱起，以20°-30°为佳。
5、备用小型毛笔、小型无钩镊子、铅笔。
二、切片的步骤：
1、将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。
2、再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。
3、根据需要调整切片厚度。
4、摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。
5、实践中可用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作。
6、切下的切片带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将切片带从刀口向上挑起，拉下切片带，然后轻拖铺于恒温水面上。
三、切片的注意事项
1、切片质量的好坏，除与技术熟练程度和切片机的好坏有关外，切片刀是决定的因素，所以刀一定要磨得十分锋利。否则在切片时会自行卷起或皱起，或将组织划伤出现刀痕，更不能顺利地将切片切成连续地长条带状。切片刀如有缺口存在，将使制成的切片断裂、破碎，不完整，切片时应时时擦净刀口。
2、切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。在每次更换蜡块时，应习惯地检查一下组织块是否夹紧，切片刀是否稳固，稍有疏忽就会影响切片质量，甚至将蜡块全部切坏，造成不可弥补的后果。在切制切片的开头阶段如出现切制不良与其他故障，最常见的原因是蜡块或切片刀的松动所致。
3、在摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则可因用力过重而使机身震动，造成切片厚薄不均。遇有硬化过度的脑、肝、脾等组织时，更应该轻轻切削，以防组织由于震动形成空洞现象。
4、在夏秋季节进行切片时，应使用冰块加强冷却，这样不仅可保持石蜡的硬度，同时也减少了切片的褶皱，给切片制作带来方便。
四、贴片：
1、将单张或数张切片，用镊子夹住蜡片的一边并提起，铺于恒温水中，（光亮的一面朝下）立即用毛笔轻轻拉展以切片无皱褶为最好。如有皱褶时用镊子细心地逐个轻轻拨开，注意不可拨破组织。然后分开每张切片，选取其中最完整的，没有皱褶的切片。
2、待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以涂有蛋白甘油面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起，趁玻片上仍有少量水份时用毛笔，拨正切片位置。如组织较小，可在玻片上多贴几片或几排，但排列应密集、整齐。
3、用铅笔在玻片一端的毛玻璃上写上标本编号，字要写得小而清楚、端正。
4、将附贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可进行染色。
第四节 特殊组织石蜡切片制作
在这一点上须明确：组织只要是经过适当的固定、脱钙（如果需要），完全脱水，透明和浸蜡等程序，切制时切片刀锋利以及切片机调整合适，有99.9%的组织都切割制出相当好的切片。只有在极罕见情况下组织虽经上述正确处理仍难切制。当遇到此种情况时，可采用下述方法弥补。
切制困难主要有两种情况：（1）组织太硬；（2）切制时组织易碎。（如皮肤、骨骼或血凝块）
无论是组织切制遇到困难还是组织未做先期的防护处理，均可将组织浸入香柏油中软化，然后再以二甲苯洗去香柏油，重新浸蜡包埋，再以常规方法切片。
切片时组织易碎：
不管蜡块的切面是否用冰块冷却，（组织含多量血液时最易碎）可在每次切片时在蜡块面上用火棉胶覆被；将蜡块切面擦干，用毛笔蘸取1%火棉胶液涂在切面上，稍停数秒钟待火棉胶干燥，再按常规切片。每切一张蜡块须涂一次火棉胶膜。须注意的是当附贴这种切片除去皱褶时，蜡片的胶面应向上，而水温要比通常略高以抵消胶膜的作用。切片干燥后在二甲苯脱蜡之前还要用等量酒精和乙醚除去火棉胶膜。
第五节 石蜡切片的异常及处理
一张理想佳良的切片，除组织固定适当和染色清晰之外，还应具备：薄、平整，无皱褶压缩，无裂损抓迹及擦痕，同时贴片排列密集，整齐位置适当，透明度好，封片用胶适量，盖玻片端正，无气泡等。
一、 影响切片质量的因素（表一）
制片程序 影响因素
取材 组织形态不规则，过大，厚薄不均
组
织
的
处
理 固定
脱水
透明
浸蜡
包埋 不及时：固定液选择不当
脱水不良；或时间过长
透明过长；或透明不足
时间不当；石蜡质量不纯，熔度选择不当
石蜡的硬度组织位置安排不当，包埋不平、碎组织散乱
切片 切片刀不够锋利，刀身角度固定不当
切片机性能掌握不够，保养不当
技术熟练程度不够
二、 石蜡切片中的异常及原因和处理方法（表二）
异常表现 原因和处理方法
切片纵裂或纵断 1、刀刃损，须磨、鐾。
2、刀口粘附细丝维，须擦净刀口。
3、组织内有细小过硬异物或骨质等。剔除异物，骨质脱钙。
切片弯曲或滚卷 1、刀钝须磨或鐾。
2、刀的倾角过大，调整。
切片厚薄不均，宽窄相间，或在每张切片上有厚薄区带 1、切片机调整螺旋须紧固。
2、组织过硬，需用软化剂处理，湿润组织切面，稍冰冻，均匀而慢切。
3、刀的倾角过大，须调整。
切制时组织破碎 1、刀钝，须磨。
2、蜡太软，须用冰块处理蜡块切面。
3、蜡内形成冰晶，凝固时冷却得慢或含水及透明剂，须重新脱水。
4、温度过高使组织变硬变脆，先用温水浸润而后切。若有过多的胶质，则可浸入70%酒精甘油软化后切片。
切片带呈弧形弯曲 1、组织形状不规则，蜡边缘区不平行并与刀刃不平行。
2、由于阻力不同，切片带组织内成分复杂，向阻力小的方向弯曲，修蜡块应视组织情况将蜡块切修成倒梯形，阻力大的一侧窄些，小的一侧宽些。
3、切片过厚，刀角偏大，刀钝须磨或鐾调整厚度及刀角，选择锋利处切片。
组织压缩，切片变窄，切片周围蜡边粘连使皱褶不易展开。 1、蜡块被压缩，系由于刀刃斜面不平，须研磨、鐾刀。
2、组织内纤维成分过多，细心处理组织。
3、组织浸蜡不足，石蜡硬度不够，室温过高，冰蜡块增强蜡块硬度或选换硬蜡。
4、组织块不必要的过大。
切片出现抓痕和擦迹 1、刀口不清洁，时时擦净刀口。
2、刀钝+组织内结缔纤维较多，其中还有钙化灶，异物、毛、发、线。剔除异物，选择刀口锋利处切片。
3、刀刃有细缺口，须磨刀。
间歇出片 刀、刀座、蜡块固定过松，须旋紧螺旋。
切片带中组织皱褶（呈泡样皱褶） 1、蜡块组织双侧留有蜡边，切片前组织两侧石蜡全部切除。
2、组织厚薄不均脱水变形，包埋不平，取材时注意厚薄均匀，注意组织脱水处理，包埋要平整。
3、碎组织包埋时排列不整齐，密集、组织成分较复杂。包埋应将碎组织排列密集整齐，切片水温不宜过高，摊片后尽量缓缓拉展。
切片不成带 切片贴在蜡块上 1、刀钝，擦净刀口，选锋利处切。
2、组织内纤维成分过于集中（如皮肤）消化道组织切片时将皮下组织或浆沫置于下面。
切片贴于刀口 1卷刀、磨刀。
2刀口粘附石蜡过多，擦净刀口。
〔注〕：切制石蜡切片遇到障碍大多数是：（1）刀钝或刀刃受损。（2）蜡块或切片刀的调整螺旋或是紧固螺旋拧不紧。因此，有经验的切片者在开始切制切片之前应习惯地反复核查（1）（2）这两点。
第四章 染色与染色剂
未加染色的切片在显微镜下除了能够辨认细胞和包核的轮廓以外，看不清楚其他任何结构。即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能使我们看到一些组织结构，但也是极其简单而有限的。远远不能满足观察和诊断的要求。我们不仅要通过显微镜视野来看到组织和细胞的形态结构，而且还要通过组织和细胞的形态变化来研究它的发生和发展。因此染色的技术才逐渐发展成为制片过程中的一个重要环节。它较固定、脱水、包埋、切片等步骤远为复杂，理论性强，技术要求严格，已经成为一门独立的科学，它在组织学，病理学等学科中已占有相当的地位。
第一节 染色的基本原理
染色就是利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。染色剂与组织细胞相结合而使组织细胞着色的过程与物理和化学作用两者都有关系。
一.染色的物理现象
1.溶解性：
这种染色最典型的例子就是脂肪染色，苏丹类染色剂为脂溶性染料，它可以被脂质溶解，使脂质着色，就是利用染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度这一特性。因此，当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时，染色剂就从溶液中“转移”到脂质中去，而使脂质着色。
2.吸附作用：
较大物体有从周围介质吸附小颗粒到自身的特性。有些染色则是染色剂分子通过渗透和毛细管作用而被吸收或沉淀到组织，细胞的小孔中去而着色的。例如活性炭吸附各种分子，甚至胶质和微生物等较大的颗粒一样。
二.染色的化学反应
酸性染料和碱性染料的染色作用常是对立的，而不是一致的。任何染料均可电离，离解出阳离子或阴离子。酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子；碱性染料中的碱性部分有染色作用的是阳离子，细胞内同时含有酸性和碱性物质，酸性物质与碱性染料中的阳离子相结合，如细胞核（含有核酸）黏液和软骨基质呈酸性部分被盐基性染料苏木素所染、反之碱性物质与酸性染料的阴离子相结合，如细胞浆及其内部的某些颗粒物质被酸性染料伊红所染。染料的颜色基不是在阳离子，就是在阴离子上，这些离子将因组织反应不同而发生化学结合，如显示含铁血黄素的普鲁士兰反应是最典型的例子。但是，大量染色的化学反应并不象铁反应那样明确，实际情况远为复杂。这是因为蛋白质分子是个分子量自几万至几百万的大分子，每个分子中含有很多阳离子和阴离子基因，在等电点时能形成游离的两性离子，如：
COOH COO-
P P
NH2 NH3+
P为蛋白质，是具有两性的胶体物质。它呈酸性或碱性与环境的PH值有关，如溶液的PH值小于该蛋白质的等电点则此溶液对该种蛋白质即为酸性，蛋白质就带正电，将被酸性染色剂所着色。反之，溶液的PH值大于蛋白质的等电点，则此溶液对该蛋白质来说即为碱性,蛋白质带负电，将被带有阳离子的染色剂所浸染 。
在日常工作中，长久固定于甲醛的组织切片，往往染色不良，尤其是核的着色欠佳。这是因为固定液甲醛氧化生成甲酸，组织亦随之变为酸性，所以不易被苏木素所着色，补救的办法是，先用流水冲洗组织块，然后用碱性溶液如稀氨酒精等处理使之中和，恢复正常PH值后再进行染色。
大多数染色的原理至今仍未搞清楚。有些可能是物理的，有些可能是化学的，有些则可能两种机制都起作用，正因为人们对染色的原理还没有完全掌握，所以目前还不能很好地运用原理来控制它。在相当程度上要凭借工作经验。因此“染色”成为技术性很强的一项工作。在进行每一种染色方法时，必须注意不断地有意识地去积累经验，从成功与失败中去真正掌握该染色技术。
三．进行性染色和退行性染色
组织成分着色由浅至深，当达到所需要的强度时，终止染色。这种方法称为进行性染色。一般所采用的染液浓度较低，染色过程中应该不时在镜下观察以进行控制，这样才能得到染色强度适中的效果。此种方法无需“分化”，例如，卡红染色。
退行性染色，则是先把组织浓度过度，超过所需的程度，然后再用某些溶液脱去多余的染色剂，以达到适当的深度，并使不应着色的组织细胞脱色，这个步骤称为“分化”。在分化中进行镜下观察，当然也是必不可少的。H.E染色中用苏木素染核就是退行性染色。
四．直接染色，间接染色和媒染剂
有些染色无需第三种物质参加，染色剂和组织即可直接结合着色，是为直接染色。直接染色最后达到的深度与染液的浓度和组织细胞对染色剂的亲和力相关。还有一些染色，单独燃料本身的水溶液或酒精溶液，几乎不能与组织细胞结合或结合的能力很弱，必须有第三种成分——媒染剂参与，才能使染色剂与组织细胞有效地结合起来，这种染色方法称为间接染色。
媒染剂通常是双价或三价金属如铝，铁的硫酸盐或氧化物。媒染剂有的加在染液中，媒染作用在染色的同时进行（如Ehrlich氏苏木素染色）；有的则用于染色前，媒染剂单独配成溶液，固定液本身就起着媒染的作用（如Wallory氏磷钨酸苏木素染色用Zenker或 Helly氏固定）；有时则用于染色后。媒染剂在染色中起着架桥作用，既能与染料结合又能与组织相结合，达到了促进染色的效果。例如苏木素就需要明矾作媒染剂，才能使组织着色。媒染剂往往在一些间接染色反应中几乎是必不可少的。
五．促染剂
用以加强染料和组织细胞结合能力的物质称为促染剂。如染胞浆时伊红液中滴加的冰醋酸，有加强其染色作用，增加了有色酸对蛋白质碱基的结合力。促染剂与媒染剂不同，有时为了加快染色过程，可在染液中加入接触剂促进染料与组织细胞着色，但其本身并不参与染色反应。
促染剂有如化学反应中的催化剂，少量存在就有明显的促染作用。它们的作用机制也许是降低表面张力或是改变了染液的PH值.
六．分化剂
在退行性染色中，附在组织细胞上多余的染色剂需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脱去，从而使目的物与周围组织形成鲜明的对比，同时使目的物本身的色泽也深浅适当。这种选择性地除去多余染色剂的过程称为“分化”，所使用的溶液即是“分化剂”。
分化剂大致可归纳为三大类：
（一）酸性分化剂：如冰醋酸和盐酸。它们能与媒染剂（金属）相结合形成可溶性盐类，从而打开了媒染剂和组织细胞的结合，使组织细胞脱色，另外，它能分解和防止形成染料的沉淀色素。如Ehrlich氏苏木素液当酸性时，溶液为褐红色，正是由于色素根来与铝化合成兰色的“沉淀色素”，之故，一旦将切片投入碱性溶液，则组织立刻呈现蓝色，说明沉淀色素已经形成，但若以1%盐酸酒精分化，则又恢复了红色，此即表示沉淀色素又被溶解。
（二）氧化分化剂：其作用实际上是种简单的漂白，如苦味酸，铬酸，重铬酸钾，高铁氰化钾和过锰酸钾等，这些都是一些氧化剂，可将组织上所有的染色剂无选择地氧化而呈无色，犹如漂白作用。但由于这种氧化作用的速度较慢，首先脱去的必是染色较浅的，染色较深的组织细胞还可保留部分染色剂，这样就达到了分化的效果。
（三）媒染分化剂：媒染剂能促使组织细胞和染色剂相结合。如果将已染色的切片再放到媒染剂的溶液中，则可使已经和组织相结合的染色剂脱去，这是媒染剂的另一种功能。从这个角度看，又可称之为“媒染分化剂”。它对组织既能使染料附着，又能脱去染料，二者初看似乎矛盾，其实不然，这是因为染色剂和媒染剂的比例关系不同，当溶液中媒染剂的量超过了染色剂的量时，占有压倒优势的媒染剂就把已经和组织细胞相结合的染色剂夺取过来，使组织细胞脱色，即为分化现象。当然，含染料较少的组织必然先被脱色，而着色较浓的组织随着分化时间的控制，即可保留必要的颜色，从而达到分化的目的。
既然分化剂有脱色的作用，因此分化剂本身也是脱色剂。一张褪色的切片，需要再染时，第一步就是用脱色剂加以处理。在常规染色中，分化剂必须严格掌握，再根据经验进行镜下观察，控制染色效果。
七.变色反应和正色反应
大多数染料可将组织染成同一颜色的不同深度；例如：酸性品红总是将组织染成不同色调的红色。淡绿染成不同色调的绿色。这些染色反应最后目的所呈现的颜色和染色剂的颜色相同，称为正色反应。然而有些组织成份可被煤焦类，某些碱性染料染成与染料不同的另一种颜色；如黏液用甲苯胺蓝可染成红色，而其余组织则染成不同色调的蓝色。此种染色反应最后目的物所呈现的颜色和染色剂当初的颜色不同，则称为变色反应。也叫做异染现象。这种组织称为显示异染性，这种染料叫做异染染料。显示异染现象的主要组织成分有黏液，软骨和肥大细胞颗粒。
第二节 染色剂染色的化学基础
作为一种生物染色剂，必须同时满足两个要求：具有鲜艳透明的颜色，而且能与组织细胞相结合。染色剂分子能够显示颜色的基因，称为发色团。主要的发色团有：
—N=N， —N=O， C=O ， C=C
偶氮基 亚硝基 羰基 烯基
亚硝基和偶氮基显示的颜色较强，在染色剂中有一个这样的发色团，就可染出颜色。其他的发色团则不是这样，必须有几个发色团，有醌的分子中就有四个发色团，（2个羰基2个烯基）。
大量的合成染料都是由煤焦油蒸馏得到的，它们都是苯的衍生物，所以苯环是合成染料的基础。苯本身是无色的，但其氢原子为某发色团取代后就带有了颜色。含有发色团的苯环化合物，称为色原。
苯+发色团=色原
色原还不能很好地与组织细胞相结合，即使着了色也很容易脱去。因此仅仅具有色原还不能成为染色剂，染色剂分子中还需具备促使染色剂与组织细胞相结合的基因，这样基国在称为助色团。如
—NH2 —COOH —OH —SO3H
氨基 羧基 羟基 磺酸基
氨基在溶液中形成阳离子（+），为碱性；其它羟基，羧基和磺酸基皆带阴离子（-）故为酸性。如三硝基甲苯是个色原，它虽有发色团—硝基，但因缺乏助色团，所以没有染色作用，不能称为染料。假如三硝基苯分子中的一个氢原子被羟基置换，则所生成的化合物既具有发色团而又得到了助色团—羟基，这就成了常用的酸性染料苦味酸。
这就可以看出，助色团的作用在于使色原形成盐类，可以在溶液中电离成为带电的离子，这样才能与相应的组织细胞的成份相结合。
第三节 染色剂的分类
一、按来源可以分为
1.天然染色剂：主要是苏木素，胭脂红，地衣红，番红花。
2.合成染色剂：是从煤焦油中提取的苯衍生物。在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银，氯化金，磺，锇酸，高锰酸钾等。
二、按主要用途分为
1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。
2.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。
3.脂质染色剂：苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。
三、按染色剂分子中的发色团可分为九类
1.亚硝基类：发色团为亚硝基（-NO)如萘酚缘-B。
2.硝基染料：发色团是硝基（-NO2）如苦味酸。
3.偶氮类：发色团为偶氮基（-N=N-）属于这一类的染色剂的橘黄G,刚果红,俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。
4.醌亚胺类：这类染料含有两个发色团，一个是印胺基（-N=），一个是醌型苯环，如硫堇，美蓝，甲苯胺蓝O,硫酸尼罗蓝,中性红,碱性藏红花O，焦油紫等。
5.苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘，浅绿，碱性品红，酸性品红，结晶紫，甲基缘等。
6.山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁，伊红Y等。
7.蒽醌染料：此类染色剂含有色原蒽醌，如茜素和胭脂虫酸。
8.噻唑类。
9.喹啉类。
8，9类染色剂使用极少。
四、按染色剂的化学性质分类
染色剂的干粉是稳定的盐类，它们在溶液中则电离成酸性或碱性染色剂。如酸性染色剂，能够产生氢离子（H+)或其它阳离子(Na+),而其本身成为带负电荷的阴离子者。这类染色剂一般用于染细胞浆，如伊红Y，苦味酸，橘黄G等。碱性染色剂，能产生氢氧根离子（OH --)或其它负离子(如Cl-),而本身成为带正电荷的阳离子者。这类染色剂常用于染细胞核,如碱性品红等。
1.酸性染色剂：色原——助色团——Na→[色原-助色团]+Na+。常用的如伊红，酸性品红，苦味酸，橘黄G，刚果红，水溶性苯胺蓝，淡绿等酸性染料常用以染细胞浆等碱性成份。
2.碱性染色剂：色原——助色团——Cl→[色原-助色团]++Cl。常用的如苏木素,卡红,次甲基蓝,甲苯胺蓝,硫堇,美蓝等碱性染料常用以染细胞核等酸性成份。
严格地说，酸性染色剂的溶液并不一定呈酸性。同样，碱性染色剂的溶液也未必呈碱性。所谓酸性和碱性染色剂仅指它们电离后其分子的主要染色部分是阳离子还是阴离子。因此称为阳离子型染色剂或阴离子型染色剂更为适当。
常规H.E染色中苏木素染液的PH值约为7，此时胞核的化学成份电离产生H+，而其本身成为带电荷的阴离子，所以被阳离子型的碱性染料剂所着色。伊红染液为弱酸性。细胞的化学成份从溶液中获取H+而成为带正电荷的阳离子，因此与阴离子型的酸性染色剂（伊红）相结合，染作红色，这就是H.E染色分别显示核和胞浆的机制。
3.中性染色剂：这是酸性染色剂和碱性染色剂的复合物，又可称为复合染料。是由碱性染料（色碱的盐）和酸性染料（色酸的盐）配制而成。其中染色剂的分子很大，所以往往水中溶解度较低，需用酒精做溶剂。血液学中的血液涂片经常使用的瑞氏染色剂及姬姆萨染色剂就是这种混合染色剂。其中的各种不同成分可分剔使核、胞浆和颗粒着色。
第四节 常用染色剂及配制
供组织学诊断用的优秀常规染色剂，不仅须使细胞核和细胞浆有选择性着染，也要使结缔组织着色。苏木素-伊红染色的切片适当分色，可使这些结构得以区分，胞核表现为蓝色，胞浆和结缔组织纤维呈各种色调的粉红，因此这是一种最常用的常规染色剂。
一、苏木素-伊红染色的基本原理
苏木素是最早用于生物学上的天然染色剂之一，百余年来，一直是生物学实验室最常用的组织学中细胞核的染料，它是从苏木树的树心中提炼出来的，为浅褐色结晶或淡黄褐色的粉末状物。易溶于乙醇、甘油，也可溶于热水。苏木素本身没有染色能力，它经过氧化后，能产生具有染色能力的苏木红，苏木红又称为氧化苏木素或苏木因。
苏木素变成苏木红的过程叫作“成熟”。成熟的方法一般有两种：一种是把配制好的苏木素液在开口瓶中放置两个月以上，让其在日光和空气中的氧的作用下使之氧化。故一般地盛苏木素的瓶子放在向阳处，时间愈长，染色的效果愈好。常配制一大瓶，备长期使用。另一种方法是在苏木素液中加入氧化剂，如磺酸钠，过锰酸钾，氧化汞，双氧水等。用这种方法成熟与用第一种方法者不同的是，它放置时间愈长，染色的效果愈低。这是因为苏木红被继续氧化可生成无色的化合物，故一次不宜配制过多，还应放置40C冰箱内避光保存以延长使用时间。它的优点是配制后即可使用。
成熟的苏木素对组织并无亲和力，须加入含金属离子的媒染剂，才能达到染色的目的。一般用于明矾苏木素的媒染剂为钾明矾或氨明矾。主要是利用明矾中的铝离子和苏木红结合形成的铝沉淀色素为紫蓝色，对染色质有很大的亲和力，水和酒精都不能使其褪色。用于铁苏木素的媒染剂是三价铁离子，苏木红的铁沉淀色素为黑蓝色，不溶于水，因此，故不能配制大量含媒染剂的混合液，一般用时现配，或在染色过程中，先用铁明矾媒染，然后再染苏木素，如磷钨酸苏木素染色即是。
常规苏木素染色的对比染色是用伊红，也有采用焰红，因为焰红比伊红色泽更鲜明，此外还有采用橘黄G，比布里希猩红，波尔多红等作为对比染色。
苏木素-伊红染色，在组织病理学中，是一种日常使用最为广泛的常规染色方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据。再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色。
二、染液的配制
在实验室内常用的苏木素染液有以下几种，不同的仅是染色时间以及比较每种染色方法彼此的优缺点，不过各有优劣。
（一）苏木素染液的配制方法如下
1.Harris氏苏木素液
甲液：苏木素 1g
无水酒精 10ml
乙液：硫酸铝钾 20g
蒸馏水 200ml
丙液：一氧化汞 0.5g
经典的配制方法是，先将甲液加热溶解后，密封待用，再将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸腾状态时再将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最后，将氧化汞缓慢倾入溶液中（氧化汞一定要慢慢少量分次加入，切忌急躁。因氧化汞倒入后，溶液会迅速膨胀易沸出容器外而发生危险。）此时液体变为深紫色，待氧化汞全部放入后，再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，并缓缓地连续摇晃至溶液完全冷却为止。隔夜后过滤，加入冰醋酸（按5%比例）混匀，再过滤后保存于冰箱内备用。
我们在实验工作中摸索了一种Harris氏苏木素的配制方法，染色效果很好，特介绍如下。
配方：（配制2000ml）
苏木素 9g
硫酸铝胺（铵明矾） 200g
氧化汞 7g（5—10g）
冰醋酸 100ml
蒸馏水 2000ml
器具：
3000毫升三角烧瓶 1个
200毫升量筒 1个
1000毫升量筒 1个
漏斗 1个（大）
滤纸 1大张
另备脱脂棉、电炉、湿抹布、大称量纸、流水槽等。
（器具要求达到化学洁净）
配法：
1．将苏木素溶于100毫升无水乙醇中，密封备用。
2．将200克铵明矾溶于2000毫升蒸馏水中，加热至沸。
3．去火。加入苏木素酒精搅拌，加热至沸。
4．去火。缓缓加入氧化汞。
5．微火煮至有金属膜产生。
6．去火。以湿抹布包住三角烧瓶的颈部。迅速放置于冷水浴中冷却，缓缓摇动烧瓶至液体完全冷却为止。
7．静置避光过夜。棉花过滤。滤液中加入冰醋酸（按5%的比例加入），混匀，滤纸过滤，备用。
注意事项：
1．配制好的苏木素液，未经使用的可长期置冰箱（冷藏）内保存。
2．盛液体的烧瓶要质优并且容积要大，防止忽速冷却对破裂和煮沸时液体溢出。
2.Hansen氏苏木素液
甲液：苏木素 1g
无水酒精 10ml
乙液：硫酸铝钾（钾明矾） 20g
蒸馏水 200ml
丙液：高锰酸钾 1g
蒸馏水 16ml
先将甲液加热溶解，然后将乙液加热溶解，将甲、乙两液混合。再将丙液溶解后缓缓滴入，待全部混合后，再次煮沸一分钟，冷却后过滤，即可使用。
3.Heidenhain氏铁苏木素液
甲液：硫酸铁铵（紫色结晶） 5g
蒸馏水 100ml
乙液：苏木素 0.5g
无水酒精 10ml
蒸馏水 90ml
此液要求硫酸铁铵只有紫色的透明结晶才能使用；苏木素是溶于洒精中然后加水。苏木素液需放置4-5周才能成熟。临用时将甲、乙两液等量混合后使用。（也可先将苏木素用无水酒精配成5%的贮备成熟，用时取10毫升加蒸馏水至100毫升使成乙液）
此苏木素液能染许多结构，但只能用于退行性染色法，需要熟练的分化，初学者宜用减半浓度的铁明矾分色，熟悉后再用原浓度分色。
此液与其它的苏木素染色技术有两个不同a.媒染剂与苏木素分开使用。b.所用的媒染剂亦用作为分色剂。
4．Ehrilich氏酸性苏木素液
主要应用一般染色和粘液，骨组织的染色
配方： 苏木素 2g
纯酒精 100ml
甘油 100ml
蒸馏水 100ml
冰醋酸 10ml
钾明矾 15g
将苏木素溶于纯酒精，再将钾明矾溶于蒸馏水中，溶解后将甘油倾人混合，然后加入苏木素酒精混合，最后加人冰醋酸，溶液全部混合后，应暴露在日光下使其自然成熟，时间约要三个月。（若加人300毫克碘酸钠，使苏木素迅速氧化则可立即使用。）此液贮存愈久染色力愈强。（可保持数年之久）染色时间5——20分钟，结果甚佳。
5．Delafreld氏苏木素液
主要应用于一般染色，弹力纤维的染色。
甲液： 苏木素 4g
纯酒精 25ml
乙液： 饱和铵明矾水溶液（约 10％）40毫升
丙液： 甘 油 100ml
甲 醇 100ml
先将苏木素溶于酒精，再将甲液混合在乙液中，置于白色瓶中并暴露在阳光下约一周，然后过滤，将丙液加人滤液中，待溶液呈暗灰色时再过滤，滤液密封保存。
6．Mayer氏明矾苏木素液
主要应用于一般染色，骨组织染色，及免疫组化染色。
配方： 苏木素 0.1g
钾明矾 5g
碘酸钠 0.02g
拘椽酸 0.1g
水合氯醛 5g
蒸馏水 100ml
先将苏木素及水煮沸溶解，加人钾明矾与碘酸钠，搅动直到全部溶解为止。再加人水合氯醛和拘椽酸，完全溶解后染液呈蓝紫色。加热煮沸五分钟，冷却后过滤即成。
此染液染切片5——15分钟，不需分化，充分水洗后，可使细胞核显蓝色并且非常细致清晰，通常用于对比染色。
7．Weigert氏铁苏木素液
甲液 苏木素 1g
无水酒精（或 95％酒精） 100ml
乙液 29％三氯化铁水溶液 4ml
蒸馏水 95ml
盐酸 1ml
临用时，取甲、乙液等量混合即可应用。混合时应将乙液加人甲液内，染液呈紫黑色。铁苏木素不能象明矾苏木素一样配制后可放置贮存备用，因铁与染色剂的色素根会化合生成不溶性沉淀，所以铁作媒染液时，必须与染液分别配制和分别保存，染片时临时混合应用。
由于这是一种铁苏木素，它将胞核染成黑色。能抵抗在对比染色液中所含分色剂的脱色作用，且不会被光线退色，因此比钾矾苏木素染色较为持久。
8．Mallory氏磷钨酸苏木素液（PTAH）
配方： 苏木素 0.1g
磷钨酸 2.0g
蒸馏水 100ml
将苏木素于20毫升蒸馏水中加热溶解，再将磷钨酸溶于80毫升蒸馏水。苏木素液冷却后加人磷钨酸溶液中混合，置放人有阳光处数星期至数月才成熟。此液可久放，若急用时可加人0．177克高锰酸钾促其成熟。
该染色剂对神经组织及纤维素是一种较为卓越的染色剂。
9．Mallory氏磷钼酸苏木素液
苏木素 1g
10％磷钼酸水溶液 10ml
水合三氯乙醛 6—10g
蒸馏水 100ml
暴露于阳光下氧化一周，用时过滤。此染色剂主用于中枢神经系统的染色。
10．Bohmer氏苏木素液
苏木素 1g
纯酒精 10ml
钾明矾 20g
蒸馏水 200ml
将苏木素溶于酒精稍加温。钾明矾溶于蒸馏水，两液混合置烧杯或广口瓶中，以纱布或棉花封盖，在阳光下约l－2个月自然成熟的苏木素液面可见一层金属膜样物。组织切片染色用5——10分钟，以盐酸酒精分化。
（二）分化液
1％盐酸酒精，是最常用的分化液。
配方： 70％酒精 99ml
浓盐酸 1ml
（三）还原液
1．氢氧化氨液：
配方： 浓氨水 1ml
蒸馏水 99ml
2．饱和碳酸锂液：
配制： 碳酸锂 1g
蒸馏水（冷） 78ml
3．流水冲洗还原。
（四）伊红染液
伊红为砖红色粉末状或酱红色结晶，是最常用的胞浆染料。又名为曙红，它是萤光黄的四溴衍生物。曙红本身溶于醇而不溶于水，也称为醇溶性伊红，它的钠盐，钾盐或铵盐可溶于水，因此称为水溶性伊红。
配方： 伊红Y（水溶） 0.5—lg
蒸馏水 99ml
若取用伊红Y（醇溶性）应溶于99ml75％或95％的乙醇中。若在伊红液中加人0.5毫升冰醋酸，可加速其染色过程，并使胞浆的色泽更为艳丽。
第五节 苏木素一伊红染色法
苏木素、伊红染色，简称HE染色，是组织学技术的常规染色方法。恒定优质
HE切片应该是红蓝相映，层次浓淡均为分明。
一、石蜡切片苏木素一伊红染色法的基本步骤：
脱蜡
（1）二甲苯I 15分钟
（2）二甲苯II（应完全透明） 10分钟
逐级降浓度酒精水化
（3）无水酒精I（变为不透明） 1－2分钟
（4）无水酒精II 1－2分钟
（5）95% 酒精 1－2分钟
（6）80% 酒精 1－2分钟
（7）自来水洗 片刻
染色
（8）蒸馏水 片刻
（9）苏木素液染核 10—15分钟
（10）自来水洗 片刻
（11）1%盐酸酒精分化 0.5—1分钟
（12）流水冲洗 片刻至数小时
（13）碳酸锂饱和水溶液反蓝 1分钟
（14）流水冲洗 15分钟至数小时
（15）复染 0．5％伊红水溶液（对比染色） 2—5分钟
逐级升浓度酒精脱水（若为醇溶伊红可直接人90％酒精）
（16）自来水洗（分化伊红） 片刻
（17）95％酒精I 1－2分钟
（18）95%酒精 II I—2分钟
（I9）无水酒精 I 1—2分钟
（20）无水酒精II l－2分钟
透明
（21）二甲苯I 5—10分钟
（22）二甲苯II 5—10分钟
可作透明度试验：在黑色背景下以光线照于切片如果见有乳白色斑片系脱水不足，需
再行脱水。
封固
（23）盖玻片下封固
结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其它成分呈深浅不同红色。
二、染色过程中的加热
为了缩短某些程度的染色时间，通常可用加热的方法来实现。一般是将切片或涂片浸在染色液内，连同染色皿置于37℃或56℃温箱内至所需时间。
有的染色需用煮沸或近于煮沸的技术，可将染色液在试管内煮沸后倾在载玻片上；或在注满染液的载玻片下面直接加热，直接加热会因溶剂蒸发而使染色剂发生沉淀。这可在倾人染色剂以前在切片上覆盖一块方形滤纸束加以防止。染色完成后冲洗切片时可以很容易地除掉滤纸而又不会损伤切片。
三、染色时应注意事项
一张优质的HE染色切片，绝非仅指染色而言，它包括很多方面，首先应重视“固
定”环节，其次注意脱水、透明、组织浸蜡，包埋和切片等各个步骤。一张因固定、脱水等步骤有所缺陷的切片，染色是不可能鲜艳、透明、层次分明的。解决上述各细节问题的方法已在前面各章节中均提到过。但在进行HE染色时还应注意以下问题：
1．组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则无论进行那种染色都会发生困难。脱蜡时间要充分，若溶蜡剂使用过久应及时更换以免效率降低，若室温过低，可将溶蜡剂置于温箱中进行脱蜡。
2．苏木素染液使用一段时间后表面易出现亮晶状飘浮物，这可能是液体表面的过氧化物，必须过滤除去，以防沉渣污染组织切片。苏木素液一般染过三、四百张切片后，着色力会减弱，着色不鲜艳，呈灰蓝色时应及时更换新液。
3．染色的时间长短需依据：染剂对组织的染色作用，室温条件，切片厚薄，固定液的类别，染液的新旧而进行调节。所以在染色时必须使用显微镜观察染色程度以利掌握时间。
4．分化十分重要。分化步骤的准确也是染色成败的关键，若分化失当则必然引起染色不匀或过淡，过深等现象，因此分化后一定要镜检，观察胞核是否清晰，胞浆呈淡白色。否则需再次分化，不然一旦复染后，组织会呈紫蓝色即“蓝盖红”现象。
5．还原液不宜过浓，若碱性太强易使组织脱落故以淡为宜。
6．伊红宜淡染，复染过深胞核会不清晰，影响镜检。
7．若脱水，透明等步骤不够彻底，则组织表面会有一层雾状膜。若有这一现象，应立即更换纯酒精脱水，再次透明。在潮湿的季节里应注意酒精的浓度、若降低要及时更换。
8．染色后的组织切片、要将组织四周的污染物痕迹擦掉，以免影响美观。
9．封固剂要适量，滴加时应小心倾滴，盖玻片要轻轻放置，以免气泡产生影响镜检。盖玻片大小选择要合适，一般要大于组织块，以防封盖不全，盖玻片要放正，标签贴牢，编号清楚。从而保证切片的封藏和美观。
10．染好的切片应妥为保存，更应避免日光照射，否则切片容易褪色。
第六节 封固剂
由于组织学制片需随时检查或保存，故要在盖玻片下封固。封固剂又称婊媒，顾名思义，它既能使染色后的组织封固于载玻片和盖玻片之间，不使直接与空气接触，避免氧化褪色。另一方面使组织切片在封固剂的充实下，其折光率能和玻片的折光率相近，从而获得清晰的镜检效果。（玻片折光率为1．518）
封固切片的介质需根据多种因素而定。常用的有两类：
1．含水封固剂：如甘油，甘油明胶和 Apath糖浆等，用于未染色的材料，脂肪染色，异染染色等。
如：甘油明胶常用于脂肪染色的冰冻切片
Apath糖浆则用于证明淀粉样变的结晶染色法中。
此类封固剂使用方便，组织切片不必经过脱水、透明等步骤即可封固。但切片仍可以久存。
2．无水封固剂：如中性树胶，大马树脂及人工树脂等。用于石蜡，冰冻和火棉胶切片的封固，使用时组织切片必须脱水，透明彻底，不然片中会出现云雾状混浊，妨碍镜检。
通常这些封固剂系将一种树脂（天然或合成的）溶于其天然溶剂或二甲苯内直至呈适当的易干易凝的流体状以便封固。其粘稠度以便易排除气泡且在盖玻片与切片之间能自由流动为好，稍稠一点则可避免干燥后在盖玻片下形成空气间隙。
选择一种封固剂，应以对所用的各种染色剂不褪色为原则。
如：用碱性苯胺染料染色需封固于不含酸的封固剂内。象普鲁士蓝反应的切片应封固于非还原性封固剂内。
封固剂还应具有准确的折光率：
未染色组织最好用有很高或很低折光率的封固剂封固。而染色的切片则以折光率在1．52至1．54之间的封固剂封固则透明度最佳。
我们常用的无水封固剂为市售的中性二甲苯树胶液，亦称中性树胶；为无色或淡黄色的透明液体，因酸或碱性封固剂均可引起组织切片的褪色，故宜用中性封固剂。封固剂应保存于有色瓶中避免日光照射，并存放于暗处以防酸变。
中性树胶是很好的封固剂，不仅折光率（1．52）及色散作用都近似于玻璃，而且在很薄一层时几乎是完全无色透明。用以封存HE染色的切片则色彩非常鲜艳。干固后即变硬，能把盖玻片和载玻片紧紧地粘在一起。仅有的缺点是随着保存时间的延长，树胶逐渐使二甲苯氧化，产生甲苯酸及邻苯二甲酸能使碱性染料褪色。
（王翠兰、高友晶）
