综述－－这是近两天完成的一片尝试性的机械综述（为了交差），时间紧，实力有限，欢迎大家拍砖。
中枢神经系统的膜片钳的四种方式
1976年，德国的两位细胞生物学家埃尔温 . 内尔（Erwin Neher）和贝尔特 . 萨克曼（Bert Sakmann）[1]建立了一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多数离子通道分子活动的技术，成为膜片钳技术（Patch Clamp）[1-3]。这一技术使对细胞电活动的研究精度提高到1pA的电流分辨率，1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率水平，是细胞和分子水平的生理学研究领域的一次革命性突破。它与基因克隆技术（Gene Cloning）并驾齐驱，推动了生命科学研究的迅速发展。为此，1991年的诺贝尔医学与生理学奖授予了这两位学者，以表彰他们的突出贡献。该技术经过不断改进，目前已广泛应用于生命科学内各个领域的研究．1990年武汉华中理工大学成功研制了第一台国产膜片钳仪，促进了膜片钳技术在我国的蓬勃发展．这一能精确描述细胞通道特征的实验方法在问世后的短短三十年时间里，已经在生物学研究领域显示出了非常重要的意义和广阔的应用前景。
因生物细胞膜片钳技术的广泛运用细胞分子水平的中枢神经系统研究在近二十年内得到迅速发展。运用这项技术可在亚细胞水平上研究单离子通道的开关动力变化。细胞制备是膜片钳电生理研究的重要一环,电极尖端与细胞膜表面的成功封接是膜片钳记录的关键,其中细胞形态及功能活性是影响封接的十分重要因素,因此,制备分散的表面光滑洁净、轮廓完整清楚、形态典型、特性正常、成活率较高的神经细胞是膜片钳记录的前提。目前国内外主要采用细胞培养法和急性酶分离法获得单个神经细胞。部分实验室已经开展在体膜片钳技术和红外可视脑片膜片钳技术。现将适合于中枢神经系统膜片钳技术细胞制备这一重要环节的予以简述。
细胞培养法
膜片钳技术使用最广泛的标本是分散的细胞和组织切片。神经细胞的分散培养是20 世纪70 年代发展起来的一项技术。最早培养的是外周交感结神经元,稍后中枢神经元的培养也获成功。Banker[4] 等于1977 年首次报道了对胚胎大鼠海马神经元的分散培养。在体外培养过程中,海马神经元可从分散损伤中完全恢复,并生长发育为具有较完整的形态结构和生理功能的细胞个体,同时形成均匀的突触联系。与急性分散的神经元或海马脑片相比,机械损伤造成的影响大大减少,而且研究对象可精确到单个细胞水平。同时急性分离的神经元在体外存活时间常在数小时之内,不适于长时间神经元电生理研究;目前已有一种操作简便、快捷、适用于膜片钳记录的原代培养海马神经元方法，且研究结果显示分离海马神经元成活率高、体外培养成活时间长,具有典型锥体细胞形态,一条长轴突、2～3 条短树突及多级分枝,并且,神经细胞表面光洁、轮廓清楚,细胞封接成功率高,因此体外培养海马锥体神经元具备适用膜片钳研究的前提条件,比国外报道方法操作更简便、快捷。与其他细胞分离培养相同的是,海马神经元分离、培养也需要严格无菌操作,具有相似操作步骤和培养条件。由于海马神经元在体外生存能力较为脆弱,分离、培养过程中,需要更加注意其中的关键环节: ①鼠龄是影响分离效果重要因素,一般来说,鼠龄越小,越易于分离细胞,1 日龄的SD 鼠较为有利于采集神经细胞; ②酶消化有利于分离细胞,常用01125 %～0125 %(g/ L) 胰蛋白酶消化,新生鼠消化时间多为2～5 min ,长时间消化将影响细胞活性、膜受体表达及细胞成活率;消化过程中,加入0104～0108 (g/ L)DNA 酶有助于清洁细胞表面; ③吸管机械吹打是分离神经元所必要的,但是用力过猛将导致大量细胞膜破裂,并影响其他细胞表面光洁度,因此,分离时常用经热抛光吸管轻轻吸打数次,并尽量缩短细胞分离时间; ④血清是细胞培养的天然培养基,优质的胎牛血清为神经元和神经胶质细胞提供丰富营养成分,维持培养细胞生长,马血清对神经元生长也有积极作用; ⑤阿糖胞苷是抑制非神经细胞生长的重要措施,5～10μmol/ L浓度阿糖胞苷处理24 h ,足以显出其抑制效果; ⑥及时更换培养液有助于维持细胞生长活性,一次换液1/ 2～2/ 3 ,但阿糖胞苷处理后需要全量换液; ⑦维持培养体系中pH值稳定也非常重要,除持续通混合气外,必要时可以加入10 mmol/ L HEPES。
急性酶分离法
除培养细胞外,酶急性分离技术已成功地从豚鼠和大鼠标本上分离出完整的神经元[5],并证实许多电压依赖性通道和递质门控性通道未被破坏[6]。改进后的分离技术,简单快速,能够制备大量神经元,并保存其形态和电学特征, 并用膜片钳技术进行检测，可供生物学研究使用。分离过程中关键在于[7]: ①脑片制备快速,5 min 内完成,厚度须在400～600μm ,过厚、过薄或过度挤压都会影响分离效果; ②孵育的目的在于缓冲脑片制备过程中对脑组织的损伤,一般1 h 即可达到预期效果; ③ 消化酶用时即配,防止酶活力下降; ④脑片吹打须轻柔,次数以2～3 次为宜,次数太多会加重细胞损伤。海马神经元细胞分离法是一种结合酶消化和机械分离的方法[8],既不损伤神经元的形态,又保留了神经元细胞膜的电学特征。形态上有差异的细胞易于分辨。用内面向外式膜片钳和全细胞膜片钳技术证实,约95 %的神经元可观测到电流活动。
脑片膜片钳实验方法
1966年，Yamamoto和McIlwain首次在脑片上记录了电生理活动[9]，证实了脑组织在体外也能存活，并保持很好的活性状态。此后，该方法在生理学研究中的应用越来越广泛，并为中枢神经系统生理和药理学领域突飞猛进的发展奠定了基础。1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来，建立了脑片膜片钳记录技术，活性较好的脑片还可用于生物化学或解剖学的分析。海马脑片是中枢神经系统研究中应用最为广泛标本之一。其原因有以下几点：1、海马与脑的其它部位相对隔离，较易剥离，且剥离后受到的损伤较小；2、海马具有高度分化的片层结构，一方面，海马神经环路在片层中的分布有一定的空间规律，如锥体细胞胞体分布在锥体细胞层，而雪氏侧支突触分布于辐射层，且海马中存在一个三突触联系的回路，即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏侧支-CA1区锥体细胞层等，因此，在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应；另一方面，这种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。脑片全细胞记录的基本原理与培养细胞、分离细胞全细胞记录原理一致t但在封接前的具体操作方面，脑片全细胞记录有其特殊之处。问题主要来自2个方面；① 非直视条件下的电极定位；②神经元周围基质和胶质细胞对高阻抗封接的可能干扰。对于后者可采用物理或酶学的方法以消除可能的影响。
离体脑片的电生理研究在20 世纪50 至60 年代逐渐得到重视。脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路,便于研究神经通路的突触活动;另一方面,应用脑片还排除了血脑屏障的干扰,可通过灌流液加入药物,直接观察药物对神经传递的影响。到20 世纪80 年代末,脑片全细胞膜片钳技术出现[10]。为获得清洁的细胞表面主要采用脑片撕裂法(酶消化) ,表面清洁法(电极正压吹) 等。为达到在可视状态下封接细胞,加用红外微分干涉相差显微镜( IR2DIC) ,以清晰地观察到脑片上神经元及其突起的形态。
在体膜片钳技术
随着研究的深入,科学家意识到在细胞或组织水平观察到的生理或药理作用最终必须回归到整体动物上加以验证,因此,直接建立在体膜片钳技术成为必然的选择。在体膜片钳是指在麻醉动物上直接对其脊髓或大脑神经元进行膜片钳记录的技术。与分散神经元或组织片膜片钳技术比,最突出的优点是能够在整体条件下研究中枢神经元离子通道和突触活动的生理特点。20 世纪90 年代一些实验室在借鉴脑片膜片钳技术的基础上,尝试在整体动物(一般是麻醉状态) 上进行膜片钳记录。最早的报道是Pei 等和Volgushev[11, 12] 等在德国马普研究所的工作。他们通过对成年猫视皮层神经元进行全细胞记录,然后观察来自不同方向的光刺激所对应的突触后电流反应,以此探讨视觉信号传递和形成机制,以及视皮层神经元功能和结构的关系。随后日本和美国的两家实验室几乎同时把记录的部位从大脑神经元改到脊髓神经元(laminae Ⅰ2 Ⅱ区) ,用以研究肌体对各种伤害性或非伤害性刺激反应的神经通路。
对猫或大鼠进行在体膜片钳记录时,前期准备主要有:动物麻醉后,继续静脉滴注麻醉剂以维持深度麻醉状态,同时适量补充葡萄糖;由于给予肌松剂后造成动物呼吸肌麻痹,所以必须做胸廓切开术并使用人工呼吸机,同时检测CO2 潮气量、血压、心跳等。以上准备完成后,动物固定于立体定位仪,进行解剖以暴露神经元。为减少局部运动和分泌,可使用麻醉剂溴化双哌雄酯(pancuronium bromide) 或阿托品。当电极接近脑表面时,在电极周围灌注温热的琼脂以覆盖暴露的脑表面,保持脑表面的湿度。琼脂凝固后还起到缓解脑血管波动的作用。整个实验过程要使用加热装置,保持动物体温恒定于37 ℃。这些繁琐的步骤必须完成,以最大限度地减少呼吸循环运动等造成的系统不稳定性。有学者认为保留硬脑膜可减缓脑部的波动。通过胶原酶消化,使硬脑膜变软以利于电极穿插。这样可减少脑组织的膨出,但是电极经过硬脑膜时的损伤几率大大增加。另一个难点是形成高阻封接困难。目前在体全细胞记录仍采用“盲插”,即在看不到细胞的情况下进行电极穿插。由于在体神经元的体积较小,这样电极是否遇到细胞就很难判断。另外,在体情况时,软脑膜几乎不可能剥离,并且神经元周围有大量的胶质细胞和纤维包围,这样电极在穿插过程中很容易堵塞。目前只有通过施加正压保持电极清洁。有实验室尝试使用辅助电极清理神经元表面。辅助电极的尖端略大于膜片电极,施加较大正压,吹散周围组织,暴露神经元。但这样增大了操作难度,并很可能损伤脑或脊髓组织,违背应用在体膜片钳技术的初衷。应选择优质硬质玻璃电极,拉制后前端陡度要小,以减小对脑组织的挤压,尖端开口也要小,约1μm ,这样利于高阻封接。在实验动物的选择上,以1 个月龄,体重100 g 的大鼠为宜。为减小振动,头部要牢固固定于立体定位仪,并把整个身体悬挂,并对所有压点和切点涂抹利多卡因。尽管目前这一技术尚未完全成熟,但随着科学技术的全面发展,在体膜片钳技术所面临的困难不但会很快得到解决,而且会发展到记录大脑深部脑区(如海马)的电信号活动。最近,Margrie 等已经结合清醒动物的细胞内记录技术和麻醉状态的膜片钳技术,尝试对清醒动物以及深层神经元的全细胞膜片钳记录。可见,在不久的将来,这一技术将为神经生理和药理学的研究打开新的局面。
展望：
电生理研究手段的膜片钳技术也在不断的发展， 日本的高桥智幸等人曾报道了组织切片膜片技术(slice patch)[13]，并提供了两种方法：在显微镜直视下进行膜片钳记录的薄切片法和非直视下进行的盲膜方法。前者需要将覆在细胞表面的组织清除掉才能形成巨欧姆阻抗。后者则不仅可以在组织切片靠近表面的细胞上作记录，而且可以对距表100tma深处的细胞进行记录，所以没有必要对记录细胞周围的结缔组织进行吹打清除。这两种方法各有所长和所短。最近取这两种方法之长处，又开发了一种红外线膜片钳法。这是使红外线透过厚的组织切片，用显微摄像机直视细胞的方法，可以对距表面50um深处的细胞进行记录。
目前国内开展的技术多以盲法膜片钳为主，在取材和操作上受到一定限制，成功率相对较低．最近，第四军医大学通过具有红外功能的微分干涉相差显微镜，在大鼠海马脑片和脊髓背角切片上成功地建立了红外可视膜片钳技术．
参考文献:
1. Sakmann, B., O.P. Hamill, and J. Bormann, Patch-clamp measurements of elementary chloride currents activated by the putative inhibitory transmitter GABA and glycine in mammalian spinal neurons. J Neural Transm Suppl, 1983. 18: p. 83-95.
2. Neher, E. and B. Sakmann, Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature, 1976. 260(5554): p. 799-802.
3. Hamill, O.P., et al., Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch, 1981. 391(2): p. 85-100.
4. Banker, G.A. and W.M. Cowan, Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res, 1977. 126(3): p. 397-42.
5. Iqbal, K. and I. Tellez-Nagel, Isolation of neurons and glial cells from normal and pathological human brains. Brain Res, 1972. 45(1): p. 296-301.
6. Brewer, G.J., Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J Neurosci Methods, 1997. 71(2): p. 143-55.
7. Almeida, A. and J.M. Medina, A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Res Brain Res Protoc, 1998. 2(3): p. 209-14.
8. Kaneda, M., H. Nakamura, and N. Akaike, Mechanical and enzymatic isolation of mammalian CNS neurons. Neurosci Res, 1988. 5(4): p. 299-315.
9. Yamamoto, C. and H. McIlwain, Potentials evoked in vitro in preparations from the mammalian brain. Nature, 1966. 210(5040): p. 1055-6.
10. Blanton, M.G., J.J. Lo Turco, and A.R. Kriegstein, Whole cell recording from neurons in slices of reptilian and mammalian cerebral cortex. J Neurosci Methods, 1989. 30(3): p. 203-10.
11. Pei, X., et al., Receptive field analysis and orientation selectivity of postsynaptic potentials of simple cells in cat visual cortex. J Neurosci, 1994. 14(11 Pt 2): p. 7130-40.
12. Pei, X., et al., Whole cell recording and conductance measurements in cat visual cortex in-vivo. Neuroreport, 1991. 2: p. 485-8.
13. Kobayashi, M., [Synaptic current analysis by dual whole-cell patch clamp recording using brain slice preparations]. Nippon Yakurigaku Zasshi, 2006. 128: p. 375-80.
