一步法RT-PCR详细步骤
1．材料和方法
Access RT-PCR System 试剂盒(A1250)：Promega公司产品。
500u AMV Rev目的基因se Transcriptase, 5u/祃
500u Tfl DNA Polym目的基因ase, 5u/祃
1ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff目的基因
1.25ml MgSO4, 25mM
100祃 dNTP Mixture, 10mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
50祃 Positive Control RNA with Carri目的基因(1.25 attomole/祃)
100祃 Upstream Control Prim目的基因, 15祃M
100祃 Downstream Control Prim目的基因, 15礛
13ml Nuclease-Free Wat目的基因
目的基因和内参照引物
1.2 方法
总RNA提取
具体步骤：
1) 称取各组的大鼠肺组织标本50-100mg，用剪刀将组织块剪成若干碎块(须避免RNA酶的污染)。
2) 将组织碎块加入1mlTripure中(所加组织块的体积不能超过Tripure体积的10%)，在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止，研磨过程在0℃冰水中进行，以防止组织RNA被降解。
3) 然后将组织匀浆液转移到1.5ml的Eppendorf管中，15℃-25℃的环境中孵育匀浆5min，使核蛋白复合体完全分离。
4) 加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，放在震荡器中剧烈震荡15秒左右，15℃-25℃的环境中孵育2min-15min。
5) 2℃-8℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)。此时可见液体分层：底层——红色酚氯仿相；中间层——界面相；上层——无色液相。
6) RNA仅存于上清中。将上清转移至新管中(切勿将中间层误吸入)，
7) 加入0.5ml的异丙醇，充分混匀，室温5min-15min。
8) 2℃-8℃冰冻离心机中离心(12000g/min，10min)。
9) 弃上清(动作轻，慢)，在管底部可见一乳白色小沉淀物，即为RNA。
10) 加入1ml75%乙醇，混合震荡，（可在2℃-8℃中保存一周，－15－25℃中保存一年）
11) 2℃-8℃冰冻离心机中离心(7500g/min)5min弃上清，
12) 通风，室温中干燥5min-10min，让乙醇挥发（根据肉眼观察管内水分情况，不能太干，RNA干后难溶解）。
13) 加入30ul-50ul的0.1%的DEPC，吹打数次，
14) 55－60℃孵育10min，冰上冷却，
15) 供下一步实验使用或-70℃冻存。
RNA完整性的检测
1) 制备琼脂糖凝胶，称取琼脂糖凝胶0.34g，加入0.5×TBE缓冲液20ml，微波炉加热至熔化。
2) 最后配成终浓度为1.7%琼脂糖凝胶液体。
3) 加入溴乙啶(0.5mg/ml)2祃，混匀。
4) 冷却至室温。
5) 在水平电泳槽上制胶，凝固后浸入0.5×TBE缓冲液中，除去样本梳。
6) 取1礸RNA与1.5祃甲醛、4.5祃甲酰胺混合， 60℃水浴10min，加入1祃上样缓冲液(0.25%溴酚蓝；40%蔗糖)，75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3处。
RNA的纯度和浓度检测
1) 预热GeneQuant并调制好各项参数，
2) 用灭活的DEPC水1000祃调零。
3) 取RNA样品1祃，加入灭活的DEPC水1000 祃，混匀。
4) 直接读取RNA浓度和Ratio，并根据稀释情况得出实际的RNA浓度，重复操作三次取平均值。
5) RNA的Ratio均在1.7-2.0之间。RNA浓度在0.5礸/祃-1礸/祃，分装10祃一管，于-70℃冰箱中冻存。
RT-PCR
引物的配制：
1. 将所合成的目的基因和GAPDH上下游引物(1OD)用0.1% DEPC水溶解。
2. 根据各个引物分子量的不同，计算加0.1%DEPC水的量。
3. 目的基因和GAPDH上下游引物所加的0.1% DEPC水量分别为：488祃，431祃，祃，祃使其终浓度均为20pmol/祃。
4. 于-20℃冰箱中冻存，备用。
RT－PCR反应体系(25ul)：
无酶水 14.4ul
AMV Buff目的基因 5ul
dNTP 0.5ul
目的基因上游引物 0.75ul
目的基因下游引物 0.75ul
GAPDH上游引物 0.75ul
GAPDH下游引物 0.75ul
MgSO4 0.8ul
Tfl DNA Poly 0.5ul
RNA 0.8ul
将上述各成分混匀并覆盖石蜡油20 祃，标注号码后放入基因扩增仪内。
RT-PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min共40个循环；循环完毕后68℃延伸7min。扩增产物进行电泳或-20篊冻存。
RT-PCR产物分析：
RT-PCR产物电泳分析
1. 取6祃 RT-PCR产物与1祃上样缓冲液混合后上样于2%琼脂糖凝胶，同时以0.8祃 Ladd目的基因点样，以0.5×TBE为缓冲液电泳。
2. 75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析。
3. 图像分析处理系统进行辉度扫描，并以GAPDH校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。
PCR产物测序
扩增好的目的基因的PCR产物(50祃)进行测序。
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