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[热点讨论] Western Blot 经验交流（有奖征集）

本主题由 saturn100 于 2008-3-2 21:31 置顶
saturn100

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46# 大 中 小 发表于 2007-10-31 08:50  只看该作者
一．配胶
1．  注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2．  分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
3．  封胶：
灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。


二．样品处理
1．培养的细胞（定性）：
⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶ 100℃，1min。
⑷ 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹ 待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：
⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g离心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清进行定量。
⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：
⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清进行定量。
⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。






三．电泳
1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。



四．转膜
1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：
湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：
将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）
3．转膜：
湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA过夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。


五．封闭及杂交
1．封闭：
将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：
一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：
根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：
二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。





六．发光鉴定
一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：
将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：
每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

七．增强敏感性
若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：
1．  用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
2．  将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
3．  封闭40~60min
4．  一抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。
5．  PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
6．  二抗杂交，37℃ 1h。
7．  PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
8．  发光鉴定。
9．  若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10．三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12．发光鉴定。



八．NC膜的多次使用
一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。
1．  如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
2．  如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用 strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
3．  对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
天涯苍苍日茫茫，风色萧萧海清凉！潮涨潮落何为是，待到功成再张扬！

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47# 大 中 小 发表于 2007-10-31 09:10  只看该作者
Western blot的原理、操作及注意事项
原理：
通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备
A：样品的制备
1 组织：
组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：
细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：
直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于 0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积 10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在 pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。
3.紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：

　　 是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。 是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。
　　　　此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（ ）在0.5～2.5之间变化。
　　所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为 0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为 10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：
　　 光密度之差求
得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。
4. Bradford比色法：
Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。
分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20祃），以0.15mmol/l NaCl补足至100祃，同时以两管100祃的0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100礸的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100礸另作一标准曲线进行测定。
5．电泳估算法（我们选择此法）：
样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。
② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。
③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
A：实际操作
1. 做胶前的准备
1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2. 制胶，电泳
1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml)
  7.5％   10％   15%
2×Sep. buffer   4   4  4
30％ Gel.sol   2.0   2.7 4
ddH2O   1.9   1.2 0
TEMED   8ul   8ul   8ul
10%APS   80ul   80ul   80ul
在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml)
  3％
2×Stacking. buffer   1.7
30％ Gel.sol   0.35
ddH2O   1.4
TEMED   5ul
10%APS   50ul
倒好后插入预先准备好的梳子。
4)待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。
B ：注意事项及常遇到的问题
1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。
2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。
3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。
4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。
5）电泳中常出现的一些现象：
︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。
︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
拖尾：样品溶解不好。
纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。
条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。
条带两边扩散：加样量过多。
三、转移
在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um  for MW<20kDa)。
A 半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。
1 实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。
目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间(h)
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10 1.5
15--40 12 0.75
<20 15 0.5
2 实验操作
（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
（2）转移
A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。
B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。
C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
D. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。
F. 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。

3 注意事项及常遇到的问题
1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。
4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

B 湿法
我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。
C 转移后效果的鉴定
1．染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。
2．染膜
有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。
四、封闭（block）
封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。
常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。
在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。

五、孵育一抗
A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。
B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，
最好采用梯度稀释。
C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上
抗原量适当延长或缩短时间。
注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

六、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。
洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

七、孵育二抗
孵育 RT1 小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。
二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。

八、洗涤
用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。 然后5mins *5。
洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

九、显色（HRP酶）
1．增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：

　　鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。
试验步骤：
1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。
3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
5）显影、定影。
6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。
注意：荧光在一段时间后会越来越弱。
2.DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。

十、分析结果及其判断
常见问题原因分析及处理方法： 见附录一、二。

附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）

附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）

附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液
1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:
Stock:             to use:
20% Glycerol   100ml       take 9.5ml stock   
10% SDS    50g or 250ml 20% SDS  add BME 0.5ml
250mM Tris   15.14g      bromphenol blue or
total     475.00ml      pyronine 4 to taste
2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):
0.8 bis-acrylamide  0.8g
29.2% acrylamide   29.2g
total      100ml
3) 2x Laemmli Separation Buffer:   
0.75M Tris-HCl   90.825g
0.2% SDS     10ml 20% SDS
total      1000ml
pH8.8
4) 2x Laemmli Stacking Buffer:
0.25M Tris    15.14g
0.2% SDS     1g
total      500ml
pH6.8
5) 10x Laemmli Running Buffer:
250mM Tris    60.55g
1.9M Glycine    285.27g
1% SDS      20g
total      2 liters
pH8.3
6) Transfer Buffer:
48mM Tris base   5.81g
39mM Glycine    2.93g
0.037% SDS    0.375g
20% MeOH     200ml
total      1000ml
7) TBST:
10mM Tris-HCl，   1.21g
100mM      NaCl
0.2%      Tween-20
Total      1000ml
pH7.4
8) Coomassie Stain :
40%MeOH     400ml
10%HAc      100ml
0.1%BBR     1g Brilliant Blue R
total      1000ml
9) Destain:
30%MeOH     300ml
7.5%HAc     75ml
total      1000ml
10) 10×丽春红染液配方：
丽春红      2g
磺基水杨酸    30g
三氯醋酸     30g
total      100ml
11）DAB
DAB       50mg
0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml
30%H2O2     30-40ul
先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％
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48# 大 中 小 发表于 2007-10-31 09:41  只看该作者
下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。


I. 所需材料： • Xcell SureLock™或Xcell Ⅱ™ Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051）
• 电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cm*9cm）
• 预先切割好的印记膜：
硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001），
PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003）
• 转印垫（Cat. No. EI9052）
• 甲醇
• 去离子水
• 转移缓冲液（配方见下文）
• 用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘


II. 规格：
转印槽尺寸： 14.5cm x 14cm x 11cm
Blot Module容积：约200ml
下缓冲液槽容积：600ml
Blot尺寸： 约9cm*9cm
注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。

Ⅲ 材料制备
a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（ 含20％甲醇的0.5X Towbin）


使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液： 去离子水 760 ml
转膜缓冲液（Cat. No. LC3675） 40 ml
(25×未稀释液)  
甲醇 200 ml
总体积 1000 ml
自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液：  
Tris 碱 (12mM) 1.45 g
甘氨酸 (96mM) 7.2 g
甲醇（20％终浓度） 200 ml
去离子水 加至1L
总体积 1L


请参看invitrogen目录648页制备NuPAGEせ撼逡骸
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49# 大 中 小 发表于 2007-10-31 10:17  只看该作者
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。 在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决

反影(白色条带,黑色背景) - -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - - - - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为黄色 - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2

信号弱或无---- - - - - - - - - - - - 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - - - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- - - - - - - - - - -- - - -优化转膜条件*注5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低--- - - - - - - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6

高背景  - - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - - - - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - ---- - - - - - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - - --- - - - -降低暴光时间*注11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12

条带内无显影的白点 - - - - - - 13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) - - 精细操作*注13
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - 14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14
---- - - - - - - - - - -- ------- - -- -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15

非特异性条带- - - - - - - - - -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - - -- - - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16
- - - - - - - - - - - - - - - --- --- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带 - - -- - - ---使用无SDS转膜液*注17

散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - -18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18

*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。

*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）

*注5 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。

*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。此外试剂公司还开发一些超级底物，其敏感度可达到pg级，但价格昂贵，对某些表达较低的蛋白效果会好些，而且也超级省抗体（其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上）。我用的是敏感度为ng级的底物，大部分western都还可以，pg级的还放在手里，没舍得用。

*注7 高背景原因是因为HRP偶联二抗结合到膜上，其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结合、洗脱不彻底等原因造成的。在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率，意即以牺牲信号强度为代价。不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。这种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其敏感（如pg级底物，因极其敏感可把结合到膜上的极其微量抗体产生的背景也显示出来，而这种背景在ng级底物即使压片过夜也没有显示），无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条带递减速度比背景还快，如果稀释抗体则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下认为需要提高抗体含量以提高条带显示程度，而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害，如是则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的（我最近带一个研究生使用pg级超级底物时发现此现象并使用此方法解决背景高的难题，当时一抗稀释为原来的4倍，二抗稀释为原来的10倍，即总稀释为原来的40倍仍然可以看到背景的荧光但条带的荧光却减了许多导致条带和背景都无法区分了，后来回复原来浓度并稍微延长孵育时间则条带荧光明显盖过背景并减少压片时间至5s解决）。

*注8 这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。

*注9 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低

*注10 一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。

*注11 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。

*注12 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。

*注13 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。

*注14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色和蛋白几无（丽春红染），这点并不多见。

*注15 这一点我是抄pierce的说明书的，我没遇到过，膜与X光片间有气泡也不影响荧光通过，这个我可以肯定。似乎不透明的东西才会导致。

*注16 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有，我也遇到过。关于wetern的抗体选择在此提出我的观点：最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，我觉得是实际中的首选。单抗虽然特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度为会下降甚至为0，故不稳定。普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际我做的抗体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中我都能做出来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。

*注17 此点我根本不知道，完全是拷贝pierce说明书的

*注18 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在4度静置（最好放在尖底的管子内），这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀，我只吸上面的，下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。
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50# 大 中 小 发表于 2007-10-31 10:18  只看该作者
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。

（1） 原理
（2） 分类
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
（3） 主要试剂
（4） 主要程序
（5） 实验常见的问题指南
1. 参考书推荐
2. 针对样品的常见问题
3. 抗体
4. 滤纸、胶和膜的问题
5. Marker的相关疑问
6. 染色的选择
7. 参照的疑问
8. 缓冲液配方的常见问题
9. 条件的摸索
10. 方法的介绍
11. 结果分析

（1） 原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。


（2） 分类
western显色的方法主要有以下几种：
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

（3） 主要试剂
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液H6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（可以参看分子克隆）

（5） 实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：

1. 参考书推荐

A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。

2. 针对样品的常见问题

B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？
解答：一般地5* 106就足够了。

D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对Western Blot有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。

E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。

H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6％， Stacking Gel 3.5％。

I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。

J. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

L. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。

O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

P. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。

Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3μg/mm2。

S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

3. 抗体

T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！

V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）

W. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

4. 滤纸、胶和膜的问题

X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？
解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

Y. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？
解答：可以。



AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？
解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？
解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。

CC. 采用tank system有什么讲究？
解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 14－16hrs。

DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？
解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。

EE. 膜一般要如何处理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

FF. 如果是6×8转印膜，要加多少一抗？
解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
解答：无要求。

HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge， 湿转36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。

KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。

LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？
解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。
PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。
还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。

5. Marker的相关疑问

MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。
解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！
解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。
2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。
3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”
是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。

6. 染色的选择

OO. Western Blot哪种染色好？
解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

7. 参照的疑问

PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？
解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗？
解答：分析一般的结果没问题。

RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？
解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。

SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？
解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。

TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？
解答：选用beta-actin就可以。

8. 缓冲液配方的常见问题

UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？
解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。

VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？
解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。

WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为 0.1%，不会是封闭液的问题吧？
解答：可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。

YY. 加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？
解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.
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byys

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51# 大 中 小 发表于 2007-10-31 12:22  只看该作者
学习啊。。。门外汉真是一窍不通。

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adobe112

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52# 大 中 小 发表于 2007-10-31 14:44  只看该作者
学习下先，等以后读研好用

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53# 大 中 小 发表于 2007-11-1 14:07  只看该作者
虽然和我的专业不太一样，还是支持分子生物版,觉得和分子生物有关的实验都能发高挡文章，呵呵，得好好学习

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xuye_902

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54# 大 中 小 发表于 2007-11-2 08:46  只看该作者
恩! 楼主我来支持下!  楼主辛苦了!
学习学习我是来学习滴

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wcblao

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55# 大 中 小 发表于 2007-11-5 20:11  只看该作者
good，good，study

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saturn100

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56# 大 中 小 发表于 2007-11-5 20:26  只看该作者
引用:
引用第55楼wcblao于2007-11-05 20:11发表的 :
good，good，study
哈哈 good good study day day up
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zxh0427

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57# 大 中 小 发表于 2007-11-8 23:01  只看该作者
我建议版主整理一下形成一个由浅入深，由原理到操作的体系，这样大家也方便学习。不让都是各弄个的缺少整体性和讨论性，或者进行分类处理，建议大家发贴子时也作一下分类，大体上是哪方面的这样大家讨论和学习就方便了，节省时间又可以让大家直接对感性趣的地方发表讨论^_^ [s:94]
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saturn100

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58# 大 中 小 发表于 2007-11-8 23:56  只看该作者
[s:94] 兄弟的建议很好，谢谢支持，我最近比较忙，等忙完这段，我就把帖子重新整理一下
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zxh0427

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59# 大 中 小 发表于 2007-11-9 18:02  只看该作者
多谢对我帖子的关注，只是个小建议而已。但是我觉得对什么问题都应该有个条理的安排，要想要这个板块活跃起来，我觉得首先是把基础和原理性的东西放在前边，然后把各家的操作及试验流程的放一起，还有就是对这个方面的最新研究进展应该有报道的，最后我想大家很希望来找自己试验碰到的问题所以，应该有个让大家讨论，提问，解决的板块这样来的人就可以根据自己的情况直接去学习和解决问题，希望这个建议对您有用（个人意见）。您也可以开一段时间的意见征集整理后我想我们这个板块就会更好了。希望来学习的人也多给版主意见^_^ [s:80] [s:94]
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60# 大 中 小 发表于 2007-11-10 10:47  只看该作者
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