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我怎么觉得做pcr最重要的是引物啊

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PCR技术简史 　 　
　 　 　 　 　
　



　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研
究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与
合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义
的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一
种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及
延伸的温度与时间。

　　PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延
伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的
DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，
但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成
一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引
起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较
高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种
耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的
90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40
%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异
性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也
大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA
Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

　　基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究 的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要的意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础， 结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途 径，并取得了令人瞩目的成果 .

　　基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的角度 来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的 范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中 期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它 是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类 型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。

PCR在突变基因检测时的应用

　　利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满 足这际工作的需要，自从PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技 术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织 亦可经PCR扩增而进行中种检测，加上PCR技术与探针杂交技术，RFLP技术及PCR直接 测序的结合，改换方法得以迅速发展和推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因 的研究进展.

一、点突变的PCR直接检出

(一)用PCR直接检测缺失:

　　当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物， 然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下检测有无特异 性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失.

　　1.一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固 定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR， 然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方 法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避光因某些原因引起的 扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因 引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应 用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩 增缺失区域，同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段，然后电泳检测.若同时 即有α和β基因的特异性扩增产物，则说明α基因的扩增产物则说明模板DNA中有α 基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征.

　　2.多对引物的多重PCR检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况 下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR体系扩增多个 外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如， 则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行 的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测 中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物 进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变.

　　3.用PCR技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检 测.

(二)单个碱量置换的PCR直接检出

　　1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR产物酶解分析

　　PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位 点及原有的酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位 点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应 的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的段进行对片分析即可确定有无酶切 位点的改变.比如状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变的改，正常情况下靶DNA 的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的 突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103 三个片段。用引方法检测突变快速可简便，但必须在突变点涉及到限制性内切酶切关 并引起进次复时不能因此方法检测，因此其应用受到限制，反能检出点突变的极少一 部分.

　　2.3'特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.

　　以上三种方法结构是基于以下机理，只是不同作者的采用的名河差别而异.

　　在PCR扩增时，引物的延伸是从其3'未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3'端 的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期 的扩增产物，若引物3'端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的 扩增产物，基于以上事实，可利用3'端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的 突变位点，此即3'特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个 PCR扩增反应，有两对引物但它们的3'端有差异，一为正常引物，另一为3'端编食突 变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩增相应的产物，而食突变的引物只 与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结 果。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个 体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应. 尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3'-特异PCR，可攻DNA分子上的多位点变 化的鉴定准确快速，简便。

　　3.PCR直接测序

　　DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部队， 而且还可确定突变的性质.PCR直接测序是指对PCR产物进行的直接序列分析，而不是 家传的测序技术先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这不仅大大的简化了操用步 骤，节省大量的人力和物力，而且可实现自动化操用，加之新的荧光检测技术的应 用，使测序的效率大大提高.

　　采用PCR循环直接测序时，应首先将扩增产物转化为单链测序模板，目前常用的 转化方法为不对称PCR，即在反应体系中引物浓度的差异来形成单链DNA，通常侧引物 的浓度为100∶1.当某一引物被耗尽后，另一引物扩增的片段即为单链然后即可用于 测序，此外，获得单链DNA还有磁珠俘获法，外切酶消化法及Genomic amplification with transcript sequeucing法(简称GAWTS法).PCR直接测序的最新发展是将双脱氧 络子技术与PCR技术相结合进行循环测序，在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利 用同位素或荧光素标记的引物引导扩增后，得模板的扩增与测序同时进行，其特异在 于使用的模板量小且不需分离单链.

　　应用PCR测序有以下优点:

　　(1)附模板的要求，模板需要量小.

　　(2)方法简便，操作易于标准化，自动化.

　　(3)测序效率高，准确，在短时间即可完成.

　　4.PCR-寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASb)

　　如果一个基因的突变部位，性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接检测突 变.该方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段(一般为19n )作为探针，与经PCR扩 增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂交式其它类型 的杂交来检测PCR产物中有无丰应突变，即探针与靶DNA片段之间只要有一个碱基不相 互配对或错记，就能检出.

　　(1)探针，探针一般合成两个，一个为正常序列，另一含有突变位点，前者与正 常靶DNA完全互解，后地只与突变DNA互补，一般长充为19bt.该探针称之为等位特异 寡核苷酸探针(allele specific oligo nucleotide probe，ASO探针).

　　(2)杂交类型，PCR技术的出现，从根本上解决了靶DNA的来源问题，使人们能在 很短的时间内获足够量的靶DNA，传统的PCR-ASO技术主要是将PCR，占物固定于杂交 膜上，然用不同的标记探针检测，亦有将已标记好的探针预先固定于杂交膜上，再使 之与PCR产物结合，检测有无完全互补的DNA产物.

　　(3)探针的标记，最先应用的标记物为放射性物质有32P，34S，但由于其来源， 半衰期及放射性危害不能普遍应用.PCR技术的引进使可在短时间内获得足够量的靶 DNA片段，因而对探针的要求亦有的降低，因非同位素标记的探针亦可获非常满意的 结果，它不仅使ASO探针使用起来受加快是简便，而且无同位素半衰期的限制，操作 亦受安全，适合于临床应用.目前已用PKU，β地贫杂的基因突变检测.

　　PCR技术是一门新型快速诊断技术，具有敏感、特异、专一性强等特点，在骨肿 瘤诊断及研究方面具有其它方法难以比拟的优越性.

　　骨肿瘤较罕见，恶性骨肿瘤只占全身恶性肿瘤的1%，男多于女，性别比约为1.6 ∶1，均好发于10-30岁间，良性者以骨软骨瘤最多，依次为骨巨细胞瘤、内生软骨瘤 等，恶性者以骨肉瘤最多，依次为软骨肉瘤、纤维肉瘤等.骨恶性肿瘤的发生机理目 前认为是癌基因显性作用与抗癌基因失活的结果，是多种癌基因多阶段多途径协同作 用的结果.骨恶性肿瘤转移涉及到肿瘤细胞自身与宿主细胞之间错综复杂的关系，受 多种相关基因的调控，即肿瘤的转移与转移基因和转移抑制基因有关，与生长因子及 其受体的表达以及某些癌基因产物有关.因此，通过对活化的癌基因及抗癌基因改变 的检测，可以快速分析患者肿瘤的易感性及判断肿瘤的预后;检测耐药基因的表达程 度，可为肿瘤的诊治提供方案选择的依据;通过对转移基因及转移抑制基因的检测， 可以判断肿瘤有无转移，对手术治疗案提供依据.

　　PCR技术是一门新型快速诊断技术，具有敏感、特异、专一性强等特点，在骨肿 瘤诊断及研究方面具有其它方法难以比拟的优越性.

一、PCR技术在骨肿瘤诊断中的应用

　　骨肿瘤诊断需要解剖学、组织学和胚胎学等基础知识，对病变需认真观察，仔细 分析，但更重要的是对临床资料及X线所见要特别重视.骨肿瘤形态变异较大，而临床 X线观察较全面，病理镜检有一定局限性，而一些癌基因改变是与某一型骨肿瘤密切 相关，即为肿瘤特异性基因，因此在骨肿瘤诊断方面在坚持临床、X线及病理三结合 的诊断原则基础上，通过PCR技术对肿瘤特异性癌基因变化的检测，可以更好地辅助 骨肿瘤的诊断，具有其它方法不可代替的优越性.

1.成骨系统肿瘤的诊断

　　本系统中恶性肿瘤最多见的是骨肉瘤，由于骨肉瘤类型繁多，有多方向分化特 点，故形态复杂，除常见的成骨型、成软骨型、成纤维型外，尚有较罕见的恶纤维 型、血管扩张型、小圆细胞型，髓内高分化型和富于巨细型的骨肉瘤.骨肉瘤虽多由 髓内发生，但也可由骨外膜发生，向外生长形成骨表面骨肉瘤.骨表面骨肉瘤近年来 又根据其形态及恶性度的不同分成四个亚型，尽管各型有其形态特征，但在常规诊断 时还是有不少被误诊.肿瘤生物学研究表明，骨肉瘤中细胞DNA含量明显高于正常细 胞，并具有一系列癌基因的改变，如骨肉瘤中75%的P53基因突变，mdm2、c-myc及 c-raf扩增，TPR-met重排等.

　　首先，我们可以用定量PCR方法检测细胞中DNA含量，来判断肿瘤的良恶性，接 着，利用多重PCR或巢式PCR检测P53、mdm2、c-raf、met等的基因改变，来确诊是否 为骨肉瘤，同样可以利用数种骨肉瘤特异的单克隆抗体，采用免疫PCR方法对骨肉瘤 进行诊断及分型.随着nm生物学技术的发展，可以利用原位PCR方法，先确定好特异性 癌基因产物的位置，然后在透射电镱下动态观察其形态及结构，这样可以更好地确诊.

2.软骨系统肿瘤的诊断

　　软骨肿瘤的恶性程度除与细胞异形性有关外，和肿瘤发生部位及其体积大小亦密 切相关.发生在近心端的如骨盆、肩胛等直径大于6cm者，即使细胞异形性不太明显， 也可能为高分化软骨肉瘤，反之若肿瘤发生在远端，虽细胞较密集有中等程度异形 性，但一般显示良性生物学行为，可诊断为良性肿瘤.软骨肿瘤分类也十分复杂，根 据形态学诊断易误诊，从基因水平来诊断更符合实际情况.首先要区分是良性肿瘤还 是恶性肿瘤，运用定量PCR方法，检测细胞中DNA含量，可以判断良恶性.其次，要与 骨及其它组织肿瘤相鉴别.研究表明，Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、骨形成蛋白、骨钙素、 骨连接蛋白等均为骨特异性蛋白，运用定量PCR方法，检测相应基因的表达程度可以 确定其组织来源，同样也可以利用相应的单克隆抗体，采用免疫PCR方法确定其组织 来源及分型.

3.骨恶性肿瘤转移的诊断

　　近几年的研究表明，癌基因mdm2的扩增与骨恶性肿瘤的转移密切相关，mn23-H1 在转移的骨恶性肿瘤中呈低表达，在分化良好的肿瘤中呈高表达.因此，运用定量PCR 方法检测癌基因mdm2扩增程度，以及mn23-H1的表达程度可以判断骨恶性肿瘤有无转 移.

4.骨恶性肿瘤治疗效果的判断

　　近几年的研究表明，微小转移灶在骨恶性肿瘤发生后不久就存在于周围的血液循 环中，骨肿瘤的手术治疗只能解决局部问题，而微小转移灶的清除必须依赖于放疗、 化疗或免疫治疗，因此，检测外周血中有无微小残余病灶，可以判断治疗效果，并对 是否需要继续治疗提供依据.

二、PCR技术在骨肿瘤研究中的应用

1.在骨肿瘤发病机理研究中的应用

　　骨恶性肿瘤是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果，到目前为止，发现与骨 恶性肿瘤密切相关的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、 c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等.发现的癌基因已有100多个，抗癌基 因有8个，它们当中究竟还有哪些与骨恶性肿瘤发生发展有关，仍有待于进一步研究. PCR技术是一门快速诊断技术，尤其是PCR相关技术的发展，给分子水平的研究带来了 一场革命.使研究的效率大大提高.

　　①骨恶性肿瘤中癌基因突变、缺失、重排的研究癌基因突变重排常导致肿瘤的发 生，因此检测癌基因的改变对研究骨肿瘤发生机理具有重要意义.传统的方法是提取 DNA，走电泳，转移到NC膜上，再用标记的探针进行杂交，检测缺失、重排、突变.方 法比较繁琐，放射性同位素对人体亦有害，而PCR技术利用一对引物就可以把待检的 DNA片段扩增出来，再利用RFLP技术或SSCP技术就可以检测出有无重排、缺失、突 变，既方便快速，又对人体没有任何伤害.

　　②骨恶性肿瘤中癌基因扩增与表达的研究　特异性癌基因的扩增与高表达常导致骨肿瘤的发生，找出这种特异性癌基因对骨 恶性肿瘤的发病机理的研究具有重大理论意义，同时，也给临床诊断骨肿瘤带来特异 性指标.传统的研究方法首先要提取DNA或RNA进行紫外定量，并用尿素变性电泳鉴定 有无降解，然后再转移或打点至NC膜上，用相应的标记好的探针进行杂交，放射自显 影，最后进行灰度扫描来定量，这种研究方法最快也得需要二周时间，而定量PCR技 术则只需50-80ng的模板DNA或RNA，扩增25个循环，就可以从计算机中打印出结果， 得出原始模板当中某个癌基因的拷贝数，可以直接判断出有无某种癌基因的扩增与高 表达.运用PCR方法筛选这种特异性癌基因，方法简便，快速，在较短的时间内可以完 成相当大的工作量.

　　③骨恶性肿瘤特异性抗原基因的筛选研究　十多年来对骨恶性肿瘤细胞株的研究表明，骨恶性肿瘤中存在一些特异性抗原与 相关性抗原，并且已经研制成了一些特异性单克隆抗体，但是到目前为止，尚未有人 筛选出骨恶性肿瘤特异性抗原的基因，传统的研究方法是首先从大量肿瘤组织中提取 肿瘤抗原，然后免疫动物，取脾脏等与杂交瘤融合，再从阳性克隆中筛选特异性的单 克隆抗体.这种单抗，运用于人体仍然可引起免疫反应，故在九十年代开始，已进行 人源性单抗的研制，尤其是丝状噬菌体呈现技术的运用，使得人源性全套抗体库的构 建获得成功，避免了免疫动物等一系列繁琐途径.全套抗体库的构建首先利用mRNA.直 接反转录成cDNA，构建成cDNA文库，根据抗体可变区基因两侧序列的保守性，设计与 之结合的一对引物，以cDNA为模板，PCR扩增出抗体可变区重链和轻链基因，用接头 DNA连接起来，再与丝状噬菌体基因Ⅲ5'端重组，表达于噬菌体表面，然后将噬菌体 抗体文库通过表面结合有特异性肿瘤抗原的亲和柱，就可以筛选出相应的人源性单克 隆抗体.然后对单抗进行部分氨基酸序列分析，反推出数个寡核苷酸，以这几个寡核 苷酸为引物，运用AP-PCR方法直接筛选出相应的抗原基因.

2.在骨肿瘤转移机理研究中的应用

　　①nm23-H1基因与骨恶性肿瘤转移相关性研究　nm23-H1基因是转移抑制基因，它已在多种肿瘤中发现与转移有关，但在骨肿瘤 中结果如何未见报道，作者拟对18例骨恶性肿瘤标本运用定量PCR仪，检测了nm23-H1 表达程度.

　　引物P1为:5'GGGACGCAACTGTGAGCGTACCTTC3'；

　　引物P2为:5'GATTGGATCCTCATTCATAGATCCAGTTCTGACC3'

　　利用带有荧光信号的通用接头把荧光信号标记在P15'端，运用定量PCR仪，以正 常肝脏组织总RNA为模板，进行一系列倍比稀释，运用RT-PCR一步法直接扩增.结果表 明，当模板为80ng时，25个循环后，扩增产物量与扩增指数呈线性关系，因此，当模 板采用80ng时，利用定量PCR仪可检测出原始模板中nm23-H1拷贝数，从而可以判断出 nm23-H1的表达程度.(研究表明，nm23-H1与骨恶性肿瘤转移有关)同理，可以运用定 量PCR仪进行多种癌基因的检测，从而筛选出与转移相关的癌基因.

　　②骨肿瘤转移基因的筛选研究　基因直选法是建立在分子杂交和PCR技术基础上的一项基因分离技术，可以运用 于骨肿瘤转移相关基因的筛选.基本原理是利用人的基因组区做诱饵，从骨肿瘤cDNA 文库中钓出其互补区，然后进行PCR反应，使钓出的CDNA大量扩增，再将CDNA克隆进 行直接测序分析，然后用定量PCR方法检测临床转移与非转移标本，看表达相差的程 度，来进一步证实是否为骨肿瘤转移相关基因.这种方法特别适用于正常情况下表达 很低的转录单位相应基因的分离.总之，PCR技术是一门非常有用的技术，掌握它可以 给基础研究及临床诊断带来难以想象的收获，尤其是PCR相关技术的发展给基础研究 带来了一场新的革命，PCR技术必将会获得越来越广泛的应用.

很常用的技术呀
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常规技术，但是是非常重要的技术，支持！
本人觉得引物设计对于PCR的成功非常重要，所以将一点引物设计的知识和大家分享
1．寡核苷酸的优化设计

  在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。
  怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。
1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性
  寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为简化起见，所有的计算都在25 ℃条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：

此主题相关图片如下：

             ΔG(kcal/mol)
  例如，双链d(ACGG／CCGT)的ΔG是：
ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol
  此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的ΔG。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal／mo1。
2. 选择引物的一般规则
  设计和选择引物时有5个要素必需注意。
2.1 引物的3′末端不互补   引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。
2.2 引物分子内不互补   应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。
2.3 引物的组分、解链温度和长度  普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。
  要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减少这种问题。
2.4 引物的内部稳定性  在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。
  如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。
  所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。
2.5 引物的唯一性   为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配，但是，通常见到的引物的3′末端往往都有6～7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。
  如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。
3. 按照氨基酸序列设计寡核苷酸
  按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段，尤其是在试图“钓取”一个蛋白质的基因时。此时要注意的问题有：
  (1)宁可用简并引物，也不用猜测的引物。氨基酸密码子的简并性给予引物设计以可塑性，这比用猜测的密码子要好得多。有人用1 024个简并引物得到很好的结果。
  但是，应当避免在一个区域内有很高的简并性。但也有简并性低使引物不工作的报道。
  (2)引物与模板的错配。一般认为，所用引物与模板有15%～20%的错配，PCR的效果还能接受。但是，引物3′末端的错配比同样错配率的5′末端错配会引起更严重的问题。
  在最后4个碱基中有2个错配的引物，其 PCR产量急剧下降。但是，当核苷酸浓度高时，3′末端有错配的引物还能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8 mmol/L时，大多数3′末端错配引物可以接受，虽然非专一产物比较多，DNA合成的忠实性也下降。即使在低核苷浓度下，还会有少量从错配碱基出发的合成，因此，在开始的PCR循环中把退火时间增加到3～5分钟，比之于用标准退火时间和高浓度核苷酸能够产生质量更好的所求产物。
  (3)在用唯一性引物时，建议用0.2 mmol/L或更低的总核苷酸浓度，因为高浓度会增加错误参入的比率。
  (4)简并寡核苷酸时，PCR应当在比较高的引物浓度下进行，即1～3 μmol/L而不是0.2 μmol/L，因为在反应混合物中的大多数寡聚物并不是被用来引发专一的反应，而只是产生高的背景而已。
2．推荐使用Primer Premier 5.0
推荐使用Primer Premier 5.0
作者：LiFeng
  下载的安装文件有4M, 安装后运行该软件, 屏幕上方是最基础的工具条,如 File, Edit, View, Search 等等, FILE下拉菜单中包括New Sequence(Protein or DNA), Open Sequence( Protein or DNA), save, save as, Degenerate Bases, Print, Exit。EDIT下拉菜单中除包括常用的Copy, Cut, Paste 之外,还有一项Preference可以设定默认引物长度等参数。其余View, Search, Function, Translate 等其他的功能基本上可以在中央的操作框中实现。
  下面简要介绍一下操作框。 下半部分显示的是一段DNA序列, 可以改变其中的碱基，但DEMO版中不可以，序列上方有一排工具钮, 如下
  5' Sequence No： 5' 到 3' 显示DNA序列。 实际上该功能确定序列中第一个碱基的号码，可将所处理的碱基在整体中的位置加以确定。
  Header： 好像是表示这段基因的来源说明。 当基因序列来自于各大数据库格式的文件时，显示序列前的其他说明文字。
  3, 10; 碱基对以 3 或 10 为一单元显示序列。
  Find, Find next： 寻找一段特定碱基序列.(Search 下拉菜单中还有一项Go to position 可查找指定位置。)
  S, A, ds DNA： 显示源序列互补序列或双链DNA序列。
  还有两个与声音有关按钮, 无太大用。 在刚输入序列、测序后等对比文件序列与文字序列是否一致时非常重要，可以让一个人轻松对序列。
   在操作框上方正中有两个按钮; DNA, PROTEIN, 由于我用的是试用版这项功能不能使用, 但很明显这项功能可将已知DNA序列翻译为蛋白质氨基酸序列，或者是反过来。当序列是核酸时，PROTEIN可以操作，将序列翻译成蛋白；而序列是蛋白时，可以进行DNA操作，将蛋白生成对应的DNA序列。这两个键在将表达系统从一种转移到另一种的设计时很有用。在上方的Translate下拉菜单中可以对读码框和密码子进行设定和编辑, 可以设定标准密码子, 也可以设定酵母,植物,脊椎,无脊椎密码子, 还可以添加新的密码表。
   左上角纵向排列有三个Function按钮： Ⅰ, Primer； Ⅱ, Enzyme； Ⅲ, Motif 。
  Ⅰ,Primer; 在PCR和核酸杂交中设计引物。点击后出现一新框。中间偏上是DNA序列与引物, 可以用鼠标直接选择引物的位置。 序列下方显示了各项参数,还包括发夹结构，二聚体异二聚体在链中出现次数，如没有的话出现NONE钮, 如果存在该结构则为FOUND钮， 点击该钮可以察看该结构出现的具体位置， 包括这样引物的特性一目了然。
    最上方是三个功能按钮① Search ② results ③ Edit primers
     ① Search： 搜寻引物,可选择PCR引物,序列引物,杂交探针,可以自己定义在正负链中搜索，搜寻范围,引物长度,PCR产物长度，可选择自动搜索手动搜索,还可设定搜索参数,如Tm, GC, Degeneracy,3' 端稳定性, Dimer, Hairpin, 等引物参数。设定完毕点击OK即可得到结果列表,包括所有可能的引物数目,以及各项参数达不到要求筛去的引物,最下方显示的是最佳方案的个数，可以在Result项中详细察看搜索得到的结果。
     ② Result： 显示引物搜寻结果列表，可以选定正负链或PAIRS，表中显示了每个引物的位置长度，还可以点击每个引物方案察看其在链中位置及其各项参数,你还可以选择所需要的并标记。
     ③Edit primers： 可以点击链两侧的左右箭头来选定引物位置，可以任意编辑引物，添加或删除任一个碱基，修改任一个碱基，当你编辑完毕，点Analyze钮就可以察看你编辑的引物的各项参数。
  Ⅱ,Enzyme： 做序列的酶切位点, 可以应用于基因操作中酶切部位和所用酶 的选择。 最上方有两个选择：序列分析的范围；酶切位点个数选择（可低于1-6个）。点击后左右两边有一栏酶,左边为所有酶, 右边为选定的酶。
     中间四个钮分别为：
    ADD： 从所有酶列表中选定所用酶加入右侧列表,
    DELETE：从选中酶列表中删除某个酶,
    EDIT： 编辑酶列表,可以加入新的酶或删除已有酶,
    FILTER： 如果你不知道该选用那几种酶，可用此功能筛选所需酶, 可用酶切位点BP数（4BP-13BP）和 切割后的接头Overhang ( 3', 5', BLUNT, 还可以具体规定切出的接头为那几个碱基)来筛选。
  所用酶选好后点OK即可得到酶切结果, 有四种格式：
    Table： 酶切位点,位置。
    SEQ; 整段序列及酶切位置。
    MAP： 与上一项近似。用示意图的方式显示结果。
    NON Cutter： 切不动的酶
  Ⅲ,Motif： 查找特定序列, 如 -10区，-35区，AGGA BOX, CAAT BOX, 与基因表达调控有关。 最上方有两个选择：序列分析的范围；Motif位点个数选择（可低于1-6个）。 左边一栏是所有特定序列，右边是选定的，中间按钮与Ⅱ近似，只是没有FILTER功能。选定你要查找的东西，点一下OK就可以看结果了，与Ⅱ的结果输出一样有四种格式：
    Table： Motif的位置，数量。
    SEQ： 整段序列及Motif的位置。
    MAP： 与上一项近似。 用示意图的方式显示结果。
    Motif absent： 序列中不存在的Motif。
3．我个人感觉，先用RNA structure模拟一下mRNA结构，选择非发夹结构区，再用Primer Premier 5.0设计引物，设计出来后再用oligo验证一下，这样最保险！
不过万一不行的，RNA structure只能是个参考，不要全信，否则很难设计引物
而且Primer Premier 5.0有时对antisense的能否有配对等识别不清，oligo可靠！

我觉得版主这个题目提得错,不过如果能分一下会更好,比如说普通PCR,RT-PCR ,real-time PCR,等等,如果区分一下,回答顶帖的鸭鸭就会更有方向性,针对性!

设计引物很重要，不是所有的引物都能扩出来的，有时候要用两三对引物才行

增加人气的！
顶一下！

PCR的操做经验

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
三、注意事项
1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
四、【经验】如何确认RNA的质量各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！以下两种方法，相信大家都知道的：1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是%26lt;2.2的）。当R%26lt;1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R%26gt;2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。2）RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。3）保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了！

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