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请问哪位有RT-PCR的动画演示版，请高人给传一下，我们网上的打不开 [s:103]

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聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，在微生物感染的诊断中具有重要的价值。在PCR扩增过程中，扩增的DNA产量是呈指数上升的，经过n个循环的扩增，一个DNA分子的产量便达到2n个拷贝。PCR产物一般为1013拷贝/ml，取0.1ml即为109拷贝，而1mg人基因组DNA才含1.4

PCR扩增产物的电泳分析——琼脂糖凝胶电泳
    琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法，琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物，根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖，低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。
(一)凝胶浓度
　　凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定.
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围
琼脂糖浓度(%)  线型DNA分子的分离范围(Kb)
        0.3  5～60
        0.6  1～20
        0.7  0.8～10
        0.9  0.5～7
        1.2  0.9～6
        1.5  0.2～3
       12.0  0.1～2
(二)电泳缓冲液
　　核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解.
　　10XTBE缓冲液的配制
　　Tris硷，108克
　　EDTA，9.3克
　　硼酸，55克
　　H2O至1000ul
　　(其PH应为8.0～8.2)
　　临用时用水稀至0.5XTBE（20倍稀释）
(三)核酸电泳的指示剂与染色剂
　　1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.
　　指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.
　　染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是银染色.
　　溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.
　　银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.
(四)电泳
　　1.电泳装置:
　　电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等.
　　2.电泳方法:
　　(1)用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.
　　(2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段， 可配制1.2～1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.
　　3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.
　　4.向电泳槽中倒入0.5XTBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子.如样品孔内有 气泡，应设法除去.
　　5.在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内.
　　6.接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).
　　7.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳.一般200～400bp的PCR产物50V电压， 电泳20～40min即可.
　　(3)溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小.

PCR扩增产物的电泳分析——聚丙烯酰胺凝胶电泳
    聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析，其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。　　
  聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N'一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲 双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。
    聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表.
丙烯酰胺(%)  有效分离范围(bp)  溴酚兰*  二甲苯青*
        3.5  100～2000               100     460
        5.0  80～500                65     260
        8.0  60～400                45     160
       12.0  40～200                30      70
       15.0  25～150                15      60
       20.0  10～100                12      45
　　*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).
(一)材料
　　1.电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.
　　2.30%丙烯酰胺
　　 丙烯酰胺，29克
　　 N，N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克
　　 H2O，加至100ml
　　 装于棕色瓶内，4℃可保存二个月.
　　3.10%过硫酸铵
　　 过硫酰铵，1克  加水至10ml  4℃可保存一周，-20℃可保存一个月.
　　4.1XTBE电泳缓冲液
　　5.TEMED(四甲基乙烯基二胺)
(二)聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳
　　根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.
　　1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
　　2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角.
　　3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.
　　4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止.
　　5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10°角，可减少液体泄漏的机会.
　　6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液.
　　7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.
　　8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡.
　　9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.
　　10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.
　　11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，15～30min后取出水洗紫外仪下观察结果.
　　12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.

今天刚做完PCR,第一次做，有点失败，貌似好象有些跑不出来，不知道为什么。
反而有些每家东西的却能跑出来，像是MARK，但是我们没往里加呀，郁闷！

引用:

引用第70楼romantic于2007-12-07 18:30发表的 :
今天刚做完PCR,第一次做，有点失败，貌似好象有些跑不出来，不知道为什么。
反而有些每家东西的却能跑出来，像是MARK，但是我们没往里加呀，郁闷！

不太明白兄弟的话，能否说清楚一些，大家给你分析一下原因

路过 [s:64] [s:64]
bu cuo

顶一下，好帖子不要沉了。

基本不懂——人气帖

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