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给点小建议：
   这个是针对讨论问题的帖子的：希望版主想个办法开个至顶帖子的方法，这样大家就会近来直接看到要求助人的问题，这样很方便大家积极去展开讨论。由于来这里发帖和灌水的人不少，所以即使有人想问问题也会很快就被别人冲走的，来的人不可能把所有帖子都浏览一遍，这样很不方便，也间接导致了很多人在这求助无望。如果能开个至顶的帖子大家就可以积极展开讨论了，以后就会吸引很多的人来此关注！！！
   再者，发帖子的人也因该把问题讲的清楚一些，不然大家看了也会觉得无从下手，进而导致没有人去理睬。所以，希望来这寻求帮助的人尽量讲清楚。
   最后，我觉得是不是弄一个发帖的版规。起码发帖的应该主题鲜明一点，在鸭鸭搜索时应该能搜索到才好。有个发帖的版规可以规定不同帖子分几块，这样看到的人马上就知道需不需要，不至于大家像大海捞针一样瞎找。
   希望这个帖子能引起版主的注意

我也提个建议吧：
看过前面的帖子后，感觉很多帖子可能是从别的论坛上转贴的帖子，千篇一律，问题讲的太泛了！我希望论坛的实验高手多谈谈自己实验过程中积累的一些经验，或许对新手的启发和帮助会更大！

提高PCR 扩增特异性
1. 递减PCR（TouchDown PCR）
递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃），直到退火温度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP® DNA 指纹分析。
2. 热启动
热启动PCR 是除了好的引物设计之外，提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR 尤为有效。并且，热启动在很大程度上防止引物二聚的发生。限制Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 反应液，并将其置于预热的PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成，直到PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
3. 促进PCR 的添加剂
退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC 含量的模板，需要其他的措施。影响DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR 添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution 还有其他优点。在同PlatinumTaq DNA 聚合酶和Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时，仅需很少的镁离子优化。这样，将Platinum 技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。
4. 巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30 到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。

污染处理
（一）环境污染
1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA 脱嘌呤；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，选择UV 作为消除残留PCR 产物污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV 照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。UV 照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV 波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA 链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等）均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（ 0.13/碱基）在DNA 分子上随机分布，一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp 的片段，每条链上仅有6 处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因。

（二）反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min 后加热灭活，然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA 的序列；
2. 内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV 照射法；
4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA，2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA 的。

（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV 照射的去污染作用对500bp 以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右，因此UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR 产物或引物中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响。UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染。由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物。
3. dU 引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dU。UNG 处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb 以上）的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点。dU 引物最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU 存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-（UNG 缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。
（四） 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA 探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
（五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR）
也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端（A 区）有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物的B 区和引物C 进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。
（六）抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。

写得真好，从中学到不少东西。