漂浮导管

（一）质粒(plasmid)是常用的克隆载体
质粒是常用的克隆载体，广泛存在于包括细菌、酵母在内的多种微生物中,在宿主细胞的染色体外以稳定的方式遗传。结构上,它是一种双链环状的DNA分子。独立地自我复制及转录。有的拷贝数较低。拷贝数很高。
作为克隆载体的质粒应具备以下特点:①分子量小,稳定存在,较高拷贝数;②遗传标志;③内切酶点。
目前,商品供应。pBR322,长度为4.3kb,含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因(Ampr和Tetr)。在氨节青霉素和四环素的抗性基因中间有限制性内切酶位点,便于外源基因的插入和筛选。pUC系列质粒,全长2.6kb,由pBR322的氨苄青霉素抗性基因、复制起始位点以及大肠杆菌lac Z基因片段构成, lac Z基因片段包括8-半乳糖苷酶基因的调控序列和该酶头 146个氨基酸的编码序列。在lac Z基因中加入了多克隆位点,供外源基因的插入,可以进行颜 色筛选。pUC系列不同成员的区别在于多克隆位点的核昔酸序列不同,以便供不同的限制性内切酶切割和外源基因的插入。此外,还有pSP系列。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段,主要用做亚克隆载体。一般说来,外源 DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。


(二)λ噬菌体经过重组也可以携带外源DNA
噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌的病毒,按其生活周期分为两种类型,一类为溶菌性（lytie） ,另一类称为溶原性( lysogenic)。用做克隆载体的噬菌体有两种:λ噬菌体, M13噬菌体。
野生型入噬菌体DNA全长48. 5kb,为双链线性DNA分子,两端带有12个碱基的单链粘性末端。它含有60多个基因。其基因组可划分为三个区域:左侧区包括了使噬菌体成熟为有包壳的病毒颗粒所需要的全部基因;中间区域不是病毒生活必需 区,即该区域内所编码的蛋白质的功能与维持噬菌斑形成能力无关,但此区域却包含了与重组有 关的基因以及使噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体DNA中去和把原噬菌体DNA从宿主染色 体DNA上切割下来的那些基因;右侧区域包括了所有的主要调控成分。λ噬菌体进入大肠杆菌 后即通过粘性末端的碱基配对形成环状分子,也可以整合进入宿主细胞基因组中。因此,它既可溶菌生长,又可溶原生长。λDNA必须包装上蛋白质外壳后才能感染大肠杆菌,而包装对ADNA的大小有严格的要求, 只有相当于野生型基因组长度的75%'"'--'105%这一范围的λDNA才能被包装成噬菌体颗粒。其基 因组中只有60%（30kb）为噬菌体溶菌生长所必需,其中间接近40%的区域是非必需的,可以将 这部分切除,在此区域插入外源DNA片段。这样, λDNA可以作为载体,通过替换自身序列的 方式携带外源DNA,这种载体称为替换型载体(replacement vector)。插入的外源DNA 片段的大小为9'"'--'23kb。如无外源DNA取代,仅由λDNA左右臂连接起来的DNA分子,由于太小不能被包装,这便提供了一个挑选重组ADNA的阳性标志。
野生型入噬菌体经过改造,已衍生出100多种克隆载体,目前应用较广的是EMBL系列、 Agt系列和Charon系列等。
Agt10和Agt11载体适用于构建cDNA文库。这两个载体都属插入型载体,能克隆7 kb以下 的外源DNA片段。
λZiplox是一个新的、与λgtll类似的入噬菌体表达载体,全长43.9 kb,它具有cDNA克隆 效率高和易于筛选的特点。


(三)粘性质粒适合克隆较大的DNA片段
粘性质粒(cosmid)又称粘粒,是由λDNA的cos区与质粒重新构建的载体,具有质粒相同的结构特点,为双链、环状DNA。其克隆容量可达40"-'50kb。粘性质粒具有下列特点:①含有质粒的抗药性标记②带有入噬菌体的粘性末端(cos区)。③一个或多个酶切位点;④粘性质粒本身不大,如pHC79仅为6.5kb;⑤非重组体粘性质粒很小,不能在体外包装,因而有利于重组体的筛选。


(四) M13噬茵体适合制备单链DNA
M13噬菌体(M13 phage)的DNA是单链环状DNA分子,全长约6.5kb。M13感染细菌后, 其基因组DNA经过复制转变为双链,称为复制型(RF)M13 DNA。复制型M13可用作克隆载体。当每个细菌内的复制型M13拷贝数积累到100'"'-' 200后, DNA的合成就变得不对称,只有其中一条链进行复制,产生大量的单链DNA,并被包装到成熟的噬菌体颗粒中,然后从细菌中排出。M13噬菌体的最大优点在于从细菌释放出的颗粒中所含的是单链DNA,只与被克隆的互补双链中的-条同源,因此可用该单链作模板进行DNA序列分析。另外,利用单链M13 克隆可制备成单链DNA探针用于杂交分析,检测DNA或RNA,或者作为体外诱变的材料。
为了便于克隆外源DNA片段,在野生型噬菌体DNA的N基因和H基因之间,插入了-段 lac DNA。它包含lac启动子-操纵元件序列以及编码自一半乳糖昔酶前145个氨基酸的核昔酸序 列,而且在lac DNA中还插入了多克隆位点序列(图13-7) ,根据这些位点序列的不同,构成M13mp系列,如M13mp2、M13mp10、M13mp18、M13mp19等。lac DNA片段的插入,使该载体进行DNA重组后可利用α-互补效应进行筛选。
在M13载体的双链复制型DNA中,插入外源、DNA片段后,转化宿主大肠杆菌,在含 IPTG及X-gal的琼脂培养基中培养。挑出白色菌斑,在LB培养基中培养数小时,离心,可在上清液中制备有插入片段的单链DNA,进行DNA序列分析。而同时可从细菌沉淀中提取有插人片段的M13双链DNA。


(五)病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞
近年来开展的对人类遗传病和恶性肿瘤的基因治疗研究中,常常采用逆转录病毒、腺病毒、 强相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体,将外源基因导人受体细胞,以达到纠正遗传缺陷 或杀死肿瘤细胞的目的。多数病毒载体均已质粒化,病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元 牛、选择性遗传标记、以及pBR322的复制起始点组成。


除了上述载体系统以外,在人类基因组计划中,还使用酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome）作为载体，用于大片段DNA的克隆，以构建物理图谱。YAC的克隆容量为0.5~20b（百万碱基对），而BAC的克隆容量为0.1~0.4Mb。