最近做了两次流式，都以失败告终，现求教以下问题
1 第一次流式：采用对照组（未加药，但加了溶解药物的DMSO）做PI单样管时，可能PI加了2次（一次10ul）这会导致颜色补偿过度或不足吗？对照组和给药组的左上象限细胞比例很高，与此有关吗？
2 缩短消化时间后的第二次流式：对照组和给药组的左上象限细胞比例有所减低，仍偏高，分别是对照组：3.61％，20um实验组：21％，30um实验组15.7％，40um实验组：27.9％（第一次的对照组：13.2％，20um实验组：45.1％，重复一次的对照组19.9％，20um实验组66％）
3 PBS洗的目的是什么，洗一次可以吗？我怕损失细胞。
4 我是用的12孔板，第一次用的是3×10E5/孔，孔底细胞挤满了，第二天中间死了很多细胞。第二次用的是2×10E5/孔，孔底细胞仍很满，第二天中间也有很多死细胞，在同步化前和加药前都吸了中间的死细胞，不过吸的似乎不充分，这样做是不不正确？我们这的流式细胞仪只跑2×10E4个细胞，感觉没必要用六孔板板种1-5×10E6个细胞（可能也种不下）。下次做考虑种1.5×10E5/孔或1×10E5/孔，不知行不？
5第一次是Annexin v和PI同时孵育15min，第二次先孵育Annexin v 15min，后孵育PI 5min，这与第二次左上象限细胞比例下降有关吗？
6 第二次对照组做Annexin v/PI双染时我看见左上象限紧邻Y轴（PI）细胞散点成线状，不知这是否就是补偿过度或不足的表现？让老师微调了一下后左上象限比例由12.1％降至3.61％，可是实验组的微调却调不动。
附流式数据:第一次
  左上 右上 左下 右下
A-，PI+ ； A+，PI+ ； A，PI-； A+，PI-
对照组(裸细胞)  0.16  0.18  99.5  0.13
对照组（PI染色）  21.9  0.05  78  0.05
对照组（Annexin染色）  0.04  0.05  91.1  8.80
对照组（双染）  13.2  3.13  74.1  9.6
对照组（双染，重复）  19.9  1.33  76.3  2.43
20um实验组（双染）  45.1  2.93  50.2  1.8
20um实验组（双染）  66  0.92  32.2  0.97

[s:103] [s:103] 哪位兄弟作过流式进来看看帮个忙了