fenghao2006

大家好,我是个新手.由于课题的需要,要进行荧光定量PCR实验.有几个问题想问一下各位老师:
1.用SYBR Green I 染料是要那些和酶、镁离子和buffer混合在一起的好还是单独的只用买染料好?如果只是买单独的染料,做普通PCR的那一套试剂是否也能用来做荧光定量PCR?
2.荧光定量的PCR管和普通的是一样的吗?可不可以先用普通的PCR摸索条件后在用荧光定量PCR来做呢?
3.我看了一些文献上面的荧光定量PCR反映程序大多是95度预变性5分钟,然后95度10秒,60度1分钟,40 循环.是不是退火和延伸变成一步了啊?那么引物是不是也要求其退火温度在60度左右呢?
4.现在能够找到的仪器是ABI 5700的,在做的过程中具体要注意哪些问题呢?
在这里先谢谢各位老师了!

saturn100

1.用SYBR Green I 染料是要那些和酶、镁离子和buffer混合在一起的好还是单独的只用买染料好?如果只是买单独的染料,做普通PCR的那一套试剂是否也能用来做荧光定量PCR?
好像应该是那种混在一起的好一些
2.荧光定量的PCR管和普通的是一样的吗?可不可以先用普通的PCR摸索条件后在用荧光定量PCR来做呢?
不是一样的，需要特殊的PCR管
3.我看了一些文献上面的荧光定量PCR反映程序大多是95度预变性5分钟,然后95度10秒,60度1分钟,40 循环.是不是退火和延伸变成一步了啊?那么引物是不是也要求其退火温度在60度左右呢?
这是一个2步PCR,他把退火和延伸合成一步了，温度为60度
4.现在能够找到的仪器是ABI 5700的,在做的过程中具体要注意哪些问题呢?
不好意思，我没有用过这个机器

kgbond

1.用SYBR Green I 染料是要那些和酶、镁离子和buffer混合在一起的好还是单独的只用买染料好?如果只是买单独的染料,做普通PCR的那一套试剂是否也能用来做荧光定量PCR?
混在一起的有利于减少污染，我当时处于成本考虑，是自己配的，稳定性稍差
2.荧光定量的PCR管和普通的是一样的吗?可不可以先用普通的PCR摸索条件后在用荧光定量PCR来做呢?
管子需要透光性好的，可以用普通的摸索条件

fenghao2006

我在普通PCR程序为94度5分钟预变性,然后94度30秒变性,60度30 秒退火以及72度30秒延伸,35循环,请教各位老师我的这个程序是否可以上荧光定量PCR的仪器(用染料法检测,扩增片段200左右)?再就是ABI的机子是不是只能用60度退火延伸啊,就是说它是不是只能用2步法进行扩增啊?试剂盒是不是一定要买ABI  的,宝生物的实时定量试剂盒在ABI机子上效果怎么样啊?

jossia

我现在用的是7500，上面你所说的温度可以改动。你可以用普通pcr的温度条件试一下。还有就是你买的试剂盒应该会有推荐的温度条件吧。不过我感觉温度和2步法差不多的话应该问题不大吧？只有试试看了。
一般是着个温度条件的：95度预变性5分钟,然后95度10秒,60度1分钟,40 循环

jenniferli

建议改成两步PCR，94°C,30'',60-65°C(根据引物的Tm值） 30'',即可。另外，对引物的要求是比较高的，几个原则：最后5个碱基中GC不能超过2，GC 含量为30-60％，另外符合一般PCR的引物条件。
宝生物的定量PCR试剂盒可以用，我用的是BioRad的IQ5,Takara的试剂盒还算比较好用。同理，用在ABI上应该也可以。我们实验室还用了另外一家的试剂盒，toyobo（好像是整个），效果比takara的还好。